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公司新闻/正文
康测科技UID RNA-seq助力华中科技大学吴孔明教授团队发表Journal for ImmunoTherapy of Cancer
1761 人阅读发布时间：2023-02-03 17:28
康测科技UID RNA-seq助力华中科技大学吴孔明教授团队发表Journal for ImmunoTherapy of Cancer
引言
11月的一篇文献解读（转录因子和组蛋白修饰酶手牵手，癌症转移快快有！）介绍FOXQ1-RbBP5结合可以提升共同靶标基因启动子区H3K4me3修饰水平和激活EMT相关基因转录导致TNBC亚型，本次带来的是康测科技客户的文章，刚好也是研究乳腺癌，只不过侧重点不在机制，而在治疗方面，该客户制作了一种双特异性抗体BiTP同时靶向PD-L1和TGF-β，通过抗体性能评估以及动物治疗结果的测试，发现BiTP在TNBC动物模型中的抗肿瘤活性及其潜在机制。
研究背景
乳腺癌是女性健康的主要威胁，2020年造成全球近68500人死亡。其中三阴性（TNBC）是最具侵袭性的乳腺癌亚型，缺乏有效治疗药物的特定靶点。尽管免疫检查点疗法，即抗PD-1/PD-L1疗法彻底改变了TNBC的治疗模式，但抗PD-1/PD-L1疗法的低反应率尚未得到很好的解决。PD-1/PD-L1的治疗效果受到多种免疫抑制因素的阻碍，包括TGF-β。对于正常组织和早期乳腺癌，TGF-β通过诱导细胞周期停滞和凋亡来充当肿瘤抑制因子。然而，对于晚期乳腺癌，TGF-β通过增强转移，放疗或化疗耐药性以及肿瘤微环境（TME）重编程来促进肿瘤进展。本研究构建了靶向TGF-β和PD-L1的双特异性抗体（称为BiTP），并探讨了BiTP在TNBC中的抗肿瘤作用。结果标明BiTP在TNBC模型中表现出体外生物活性和有效的抗肿瘤活性，是进一步进行临床研究的有希望的候选药物。
研究结果
1.BiTP的结构和结合能力作为IgG1/IgG2杂交抗体，BiTP的Fc片段包含由 IgG2 衍生的 CH2 结构域和由IgG1 衍生的 CH3 结构域，通过D270A替换以降低与 FcγR 的结合亲和力。并且没有观察到BiTP有显著抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。VLa，CL，VHa和CH1均来源于抗人PD-L1的相应结构域。 VHb和VLb结构域来源于抗TGF-β的相应结构域（如下图A）。还原性SDS-PAGE显示BiTP由短链和长链组成（如下图B）。CE-SDS表明纯度超过97%（如下图c）此外，BiTP的分子量约为201.5KDa（短链：37.3KDa;长链：63.4KDa）。
与TGF-β抗体相比，BiTP与预涂平板上的TGF-β结合，其结合亲和力相似或稍弱（如下图D-F）。并且BiTP与H358细胞（高水平表达PD-L1）结合，具有与PD-L1抗体相似的结合亲和力（如下图G）。双抗原夹心ELISA显示TGF-β1捕获的BiTP同时与PD-L1结合（图H）。
2.血浆中的药物代谢动力学研究
作者研究发现BiTP在CD-1小鼠中表现出非线性药物代谢动力学。在9mg/kg的剂量下，BiTP的半衰期（t1/2）为34小时（如下图E）。在单剂量BiTP后的μMT小鼠中，其血浆中的TGF-β1和TGF-β2在2至120小时几乎完全耗尽（如下图F-G）。然而BiTP处理后的TGF-β3的浓度在所有时间点都保持在较低水平（如下图H）。
3.BiTP抗TGF-β 和PD-L1的生物活性
TGF-β的生物学活性可以通过TF-1增殖试验来确定，结果显示BiTP可以通过剂量依赖的方式逆转TGF-β引起的TF-1增殖损伤（如下图 A-C）。此外，BiTP 有效地阻断了典型的 TGF-β-Smad信号传导（如下图 D）。
对BiTP的抗PD-L1部分的生物活性作者通过含有Jurkat-1-PD-1-NFAT-Luc和CHO-K1-PD-L1-CD3L细胞的荧光素酶报告系统进行了评估（如下图E）。发现BiTP抵消了PD-1/PD-L1通路介导的对NFAT信号传导的抑制（如下图F）。且在超级抗原刺激测定中，BiTP增强了IL-2的分泌（如下图G）。T细胞活性的增强与BiTP的剂量有关，高剂量的BiTP表现出更强的促进T细胞活化的能力。
4.BiTP在小鼠模型中的抗肿瘤活性
作者在EMT 6-hPDL1和4T1-hPDL1模型中评估了BiTP的抗肿瘤作用。肿瘤细胞接种一周后，将小鼠分组并用6种剂量的抗体进行治疗。在两种TNBC模型中，BiTP表现出优于亲本抗体的抗肿瘤活性。与其他三组相比，BiTP还显著减缓了肿瘤生长并延长了荷瘤小鼠的存活期（如下图A-H）。
作者并未观察到接受抗体治疗的小鼠有明显的毒性和体重减轻现象，这表明BiTP的安全性和耐受性是可接受的（如下图I-J）。再激发试验显示，所有BiTP治愈的小鼠都排斥了再次接种的肿瘤，表明BiTP建立了有效的抗肿瘤免疫记忆（如下图K-M）。
5.BiTP抑制胶原蛋白生成，促进T细胞浸润
此前研究表明，TGF-β阻断是通过限制CAF衍生的胶原蛋白来增强T细胞浸润的。鉴于CAF来源的胶原蛋白会破坏T细胞渗透，作者首先探讨了BiTP对体外CAF活性的影响。由于α-SMA是CAF的标志物，对于原代成纤维细胞和HFL1，TGF-β1增强α-SMA表达和I型胶原蛋白的生成（如下图A）。同时，BiTP处理可拮抗TGF-β1引起的α-SMA和I型胶原蛋白的表达上调。
接下来，作者研究了4T1-hPD-L1肿瘤中的CAF活性和CD8+ T细胞浸润。α-SMA抗体染色显示BiTP和TGF-β抗体可以下调α-SMA 表达水平，表明 CAF 活性受到限制（如下图 B）。Picrosirius染色显示，BiTP和TGF-β抗体处理后胶原蛋白生成显着减少（如下图C）。
随后使用CD8抗体染色以研究免疫浸润状态，结果显示对于用hIgG或抗PD-L1治疗的小鼠，大多数CD8像素位于肿瘤边缘。相比之下，对于使用TGF-β抗体或BiTP治疗的小鼠，更多的CD8像素位于肿瘤中心位置（如下图D）。
定量分析表明，BiTP扩大了T细胞群并增加了其浸润深度。总的来说，BiTP抑制了CAF活性，减少了胶原蛋白沉积，并增强了T细胞浸润（如下图E-H）。
作者收集了4T1-hPDL1组织，通过流式细胞术检测免疫细胞群体的变化（如下图A-C）。结果显示与其他三组相比，BiTP显著增加和活化了多种T细胞和NK细胞（如下图D-Q）。除TIL，BiTP还扩大了总DC细胞和成熟DC细胞量（如下图R-T）。
7.Bulk RNA-seq解析肿瘤微环境（TME）状态
为了探究BiTP增强抗肿瘤活性的机制，作者在康测科技使用4T1-hPDL1样本进行UID RNA-seq测序（更准确的RNA-seq定量结果），结果显示不同比较组分别鉴定到了2144（BiTP vs hIgG）、2211（BiTP vs TGF-β抗体）和709（BiTP vs PD-L1抗体）个基因（如下图 A）。
将三个比较组差异基因取交集，得到总共598个交集基因（其中566个上调，32个下调）。KEGG富集分析显示三组交集差异基因与免疫激活高度相关（如下图a-d）。
正如预期的那样，一些与免疫杀伤相关基因如Ifng、Tnf、Gzma、Gzmb的表达水平在BiTP处理的样本中显著上调。通过6个免疫特征综合评价了BiTP对TME的影响，结果显示在BiTP处理的样品中，所有免疫特征的评分最高（如下图C-H）。此外，PCA分析显示使用hIgG，TGF-β抗体和PD-L1抗体治疗的肿瘤具有相似的表达模式，而使用BiTP治疗的肿瘤的基因表达模式完全不同（如下图e）。这些结果说明TGF-β抗体和PD-L1抗体单一治疗的免疫刺激作用较弱，被抑制的抗肿瘤免疫力无法完全恢复，因此BiTP可以系统增强多种免疫成分并增强抗肿瘤免疫力。
8.BiTP可以逆转EMT过程
最后，作者评估了BiTP治疗后4T1-hPDL1模型中的EMT状态，结果显示BiTP在体内可有效逆转EMT过程（如下图a,b）。
总结
1.设计和构建了靶向TGF-β和PD-L1的双特异性抗体BiTP；
2.评估BiTP的抗体结合能力、药物代谢动力学参数和生物活性；
3.通过EMT小鼠模型初步确认BiTP具有抗肿瘤活性；
4.免疫染色确定BiTP可以减少胶原蛋白形成并促进T细胞浸润；
5.流式结果显示BiTP处理后免疫细胞群体数量明显增多，暗示肿瘤微环境已发生改变；
6.通过UID RNA-seq确认肿瘤微环境中免疫细胞相关基因表达水平均上调，说明微环境已变成抗肿瘤状态，最后确认EMT过程也可以被BiTP所抑制。
2.评估BiTP的抗体结合能力、药物代谢动力学参数和生物活性；
3.通过EMT小鼠模型初步确认BiTP具有抗肿瘤活性；
4.免疫染色确定BiTP可以减少胶原蛋白形成并促进T细胞浸润；
5.流式结果显示BiTP处理后免疫细胞群体数量明显增多，暗示肿瘤微环境已发生改变；
6.通过UID RNA-seq确认肿瘤微环境中免疫细胞相关基因表达水平均上调，说明微环境已变成抗肿瘤状态，最后确认EMT过程也可以被BiTP所抑制。
Yi M, Wu Y, Niu M, et al. Anti-TGF-β/PD-L1 bispecific antibody promotes T cell infiltration and exhibits enhanced antitumor activity in triple-negative breast cancer.Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2022;10:e005543.
DOI:10.1136/jitc-2022-005543