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该工具检测RNA修饰主要分为两个阶段：1. 从头预测模型（de novo model）利用二元分类器识别可能存在修饰的kmer；2. 修饰推断模型（Modification inference model）使用注意力机制的多修饰标签神经网络来推测具体修饰类型和位点。获得高准确度、高阳性率的二代RNA修饰测序训练数据，是保证RNA修饰推断模型可靠性的关键。康测科技为本研究提供了所有二代RNA修饰测序技术服务，包括：ac4C acRIP-seq、m1A meRIP-seq、m5C meRIP-seq、hm5C meRIP-seq、m6A meRIP-seq、m7G meRIP-seq、PA-Ψ-seq和三代Nanopore DRS。

基因亚型（isoform）由选择性剪接产生，是人类转录组多样性与功能精细调控的核心来源。研究表明，超过 95% 的多外显子基因可产生两种以上亚型，其表达比例的变化与发育时序、细胞命运决定以及多种疾病机制密切相关。然而，在基因亚型层面进行准确定量仍面临根本性挑战：短读长 RNA 测序（RNA-seq）因读长限制，大量读段无法跨越完整转录本，导致不同亚型间出现广泛的比对歧义（alignment ambiguity），从而引入显著的反卷积误差（图1）；尽管长读长测序技术（如 PacBio 和 Oxford Nanopore）可显著降低比对不确定性，但其当前通量相对较低，在低表达基因中易出现采样误差（sampling error），同样限制了定量准确性。因此，如何系统评估每种基因的“可定量难度”并在实验设计阶段即加以优化，成为领域内亟待解决的关键问题。

自上世纪50年代第一个RNA假尿嘧啶修饰（Pseudouridine, Ψ）发现以来，迄今已在RNA上发现了超过170种不同类型的修饰。这些修饰广泛存在于ncRNA，特别是rRNA和tRNA中，近来的研究发现mRNA也存在着丰富的RNA修饰。2023年更是因为发现核苷碱基修饰在新冠病毒（COVID - 19）mRNA疫苗开发过程中的作用，Katalin Karikó和Drew Weissman被授予诺贝尔生理或医学奖。这无疑提示了RNA表观遗传在生物医学研究领域的重要地位，也揭开了RNA修饰研究的新篇章。

本研究利用ONT测序技术，对斑马鱼KM进行了全基因组DNA甲基化分析，比较了有无红细胞污染的样本，建立了全面的甲基化图谱。研究结果表明，ONT测序在CpG位点覆盖率和数据质量方面均优于传统WGBS方法，为斑马鱼造血系统的表观遗传研究提供了可靠的数据支持。

他们将DRS技术与RNA-seq和表观遗传学标记分析相结合，构建了一个全新的基因组注释框架，旨在为四膜虫基因组的精准注释开辟一条全新的道路。

本文详细介绍了长读长单细胞转录组测序技术的最新进展，包括其在样本制备、文库构建和生物信息学分析方面的创新，还将探讨这些技术如何帮助我们更好地理解细胞的异质性，并为未来的生物学研究和临床应用提供新的思路和方法。

长读测序技术能够提供更长的读长，从而更准确地解析转录本的完整结构和复杂的剪接事件，有助于我们全面了解视网膜细胞类型特异性的转录组特征和剪接调控机制。

随着三代测序技术的成熟，特别是Oxford Nanopore 的 Direct RNA sequencing（DRS） 技术的广泛应用，转录组研究终于迎来了能够“直视复杂性”的新纪元。DRS 实现了真正的单分子、全长、无扩增、直接读取 RNA 序列，不仅可以一次性读取完整的转录本结构，还能同时观测其修饰状态、poly(A) 尾部长度、表达定量与方向信息，摆脱了传统方法对反转录、拼接、富集等步骤的依赖，极大地减少了技术偏倚与信息丢失。

Nanopore Direct RNA sequencing（DRS），以其原始读段跨越融合位点、捕获完整转录本结构的能力，为融合基因的精准解析提供了前所未有的解决方案。它不仅让融合“被看见”，更让结构“可验证”，是融合基因研究迈入“全景化”和“真实可读”时代的重要起点。

尽管RNA修饰的重要性日益凸显，但长期以来，其研究却面临着一系列技术瓶颈。 正当RNA修饰研究亟需一场技术革新之时，纳米孔直接RNA测序（nanopore direct RNA sequencing，以下简称DRS）技术的出现，犹如一道曙光，带来了革命性的突破。 这项技术的问世，彻底颠覆了传统RNA修饰的检测范式，为我们打开了一扇通往单分子、高通量、直接检测RNA修饰的全新大门。它不仅有望克服传统方法的诸多痛点，更将加速我们对表观转录组的理解，为基础研究、疾病诊断和治疗提供前所未有的工具。

Direct RNA-seq（直接RNA测序，简称DRS）由Oxford Nanopore Technologies（ONT）推出，首次实现了在不经逆转录、不依赖扩增的条件下，直接测序天然RNA分子的能力。该技术不仅保留RNA分子的天然序列信息，还可同步获取其poly(A)尾长度和修饰状态，为解析真实转录组提供了前所未有的视角。

Nanopore DRS（Direct RNA Sequencing）技术的出现，为RNA研究带来了革命性的突破。DRS技术无需逆转录，能够直接、实时地读取天然RNA分子的全长序列，包括其修饰信息和复杂的异构体结构。这种技术不仅保留了RNA分子的原始特征，还能够以单分子水平的精度解析RNA的动态变化，为研究RNA的功能和调控机制提供了前所未有的工具。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术在解析细胞类型、状态和动态变化方面发挥着重要作用，但传统的短读长测序技术在全面表征RNA异构体方面存在不足。为克服限制，研究者们开发了单细胞靶向异构体长读长测序（scTaILoR-seq）技术，这是一种基于杂交捕获的方法，能够针对超过一千个感兴趣的基因进行靶向测序，显著提高了每个细胞中靶向转录本的中位数，为深入研究卵巢癌等疾病的转录组变异提供了有力工具。

2025 年 5 月 20 日至 23 日，牛津纳米孔科技公司（Oxford Nanopore Technologies，以下简称 ONT）举办了备受瞩目的 London Calling 发布会。在这场盛会中，ONT 带来了众多技术更新，其中 RNA 测序、表观和蛋白组相关领域的进展尤为引人注目。接下来，让我们一起深入探索这些技术亮点，看看 Nanopore 技术如何在生物学研究的多个层面带来新的突破，为科研人员提供更强大的助力。

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球第三大常见癌症类型，其治疗一直是医学领域的重大挑战。在 CRC 的治疗中，肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）的作用日益受到关注。TAMs 被认为能够促进药物耐受性，影响治疗效果。腺苷脱氨酶作用于 RNA（Adenosine Deaminase Acting on RNA, ADAR）是一种关键的 RNA 编辑酶，它通过诱导 RNA 的腺苷-肌苷（A-to-I）编辑，对重要的癌基因进行转录后修饰。近年来，研究发现 ADAR1 在多种癌症中表达异常，并与不良预后相关，但其在 CRC 中的具体作用机制尚不清楚。

m6A是真核生物mRNA最普遍和最丰富的一种转录后修饰，目前发现m6A修饰在发育、增殖、分化、癌症发生等很多生物学过程中起着重要的调控作用。

课题研究中，有时我们会遇到这样的情况：通过查阅文献和分子实验，筛选到目标基因。本来预想补充RNA-seq作为研究拓展和铺垫引入，结果关注的基因不在GO/KEGG富集分析结果中，也不在差异基因列表里！究其原因，竟然是关注的基因在组间的表达差异不显著。在反复检查，排除掉实验和分析问题后，我们不得不仔细思考后续该如何处理？

差异分析后，如果鉴定到的差异基因偏少，我们可以从调整实验设计（选择表型有显著差异的样本、避免批次效应）、剔除异常样本（参考相关性热图、PCA）、降低筛选阈值（FC、P Value）、更换分析软件（DESeq2、edgeR）等方面尝试解决。但如果鉴定到的差异基因太多，我们又该如何挑选关键靶标用于后续深入研究？

近些年来，越来越多的期刊杂志对WB结果进行严格要求。比如：“提供未经编辑的WB原始图像”、“进行条带间比较分析时，应在同一张膜上”、“不接受高对比度的WB图片”等，部分期刊杂志甚至要求“提供未经裁剪的WB全膜图像”！WB检测不仅是期刊杂志的重要审核对象，也在一定程度反映了ChIP实验的好坏。读懂ChIP后的WB结果，能让我们对于实验有更清晰的判断、更有底气。

在许多高分文献中，常将火山图与热图搭配使用，重点展示关键靶标筛选的思路历程。本期我们重点介绍火山图。