研究背景和待解决的科学问题
N6-甲基腺苷（m6A）mRNA修饰是mRNA中最普遍的修饰，参与基因转录后调控，并且在各种正常和病理过程中都起着至关重要的作用。
甲基转移酶复合物（MTC，m6A methyltransferase complex）由METTL3和METTL14两个核心组分形成二聚体，加上WTAP作为二聚体的co-factor，能识别保守元件RRACH（R：A/G；H：A/C/U），并对其中的A进行甲基化修饰。
为什么m6A甲基化修饰更倾向于发生在mRNA的CDS和3’UTR，特别是终止密码子（stop codon）附近？
共转录（co-transcription）是指伴随转录过程进行的、并非在转录终止之后才进行的RNA修饰加工。近来，有证据提示m6A甲基化修饰很可能是共转录发生，但相关机制还不清楚，亟待解决。
本篇Nature要揭示的主要问题，就是在转录过程中m6A修饰是如何发生的，哪些关键分子起到重要作用，以及为什么m6A甲基化富集位置存在偏好性。




m6A修饰与H3K36me3高度相关
首先，作者比较了meRIP-seq和各种常见组蛋白修饰的ChIP-seq数据，发现69.2%的m6A peaks与H3K36me3重叠（下图a），所以猜测m6A修饰与H3K36me3有关。



为了控制H3K36me3的水平，作者找到特异性修饰组蛋白H3K36me2成为H3K36me3的甲基化转移酶SETD2，并鉴定其表达量与m6A MTC基因（即METTL3、METTL14和WTAP）的表达量呈正相关（下图c）。



通过敲低SETD2（下图a）或者过表达组蛋白H3K36me3的去甲基化酶KDM4A（下图k），降低了H3K36me3的水平，都导致了polyA RNA m6A修饰下降，其效果与敲低m6A MTC基因相当。在SETD2缺失的细胞中过表达SETD2，能挽救polyA RNA的m6A修饰水平，但过表达SETD2突变体无效（下图b）。说明H3K36me3可能正调控m6A修饰。


          

然而，沉默m6A MTC基因，并未影响H3K36me3的水平（下图v），表明MTC不影响H3K36me3。



SETD2敲除后，ChIP-seq结果表明，H3K36me3的水平全局降低（下图a），stop codon区域尤甚（下图e）；同时，m6A-seq结果显示，m6A修饰水平全局下降（下图c），下降区域多位于编码RNA（下图j）且在stop codon区域附近富集（下图k），且富集了m6A最常见的保守元件“GGAC”（下图l）。


     
 






正常HepG2细胞中ChIP-seq和m6A-seq的数据联合分析发现，H3K36me3和m6A在染色体上的位置高度重合（下图d）。



进一步分析表明，与H3K36me3高相关的m6A峰（H3K36me3+）在终止密码子附近富集，而低相关的m6A峰（H3K36me3-）在起始密码子附近富集（下图d）；无m6A修饰的H3K36me3倾向于在CDS和内含子区域（而不是在3'末端）富集（下图e）。



5）~7）的结果表明，m6A修饰的位置偏好性与H3K36me3在染色体上分布高度正相关。

dCas9蛋白是Cas9蛋白的突变体，通过突变失活其内切酶，只保留由gDNA引导进入基因组的能力。因此，CRISPR-dCas9系统提供了一个定点研究转录调控的平台。作者通过该系统，将H3K36me3的去甲基化酶KDM4A/甲基化酶SETD2锚向基因MYC/GNG4，这两个基因主要结合了H3K36me3/H3K36me2，发现H3K36me3的结合水平以及m6A修饰水平均下降（下图g）/上升（下图h）。




以上扎实而细致的实验均表明，H3K36me3与m6A修饰之间存在因果关系。


H3K36me3调控m6A修饰的机制
敲低SETD2降低H3K36me3水平，削弱了m6A MTC蛋白与其靶标mRNA之间的相互作用（下图a），但不影响单个m6A MTC基因的表达（下图b）。这表明H3K36me3在募集MTC修饰RNA中具有作用。




因此，作者猜测H3K36me3能结合MTC蛋白。Co-IP结果表明，H3K36me1和H3K36me2均不与m6A MTC蛋白作用（下图i），但H3K36me3与m6A MTC蛋白之间存在特异性的相互作用（下图j）。



到底是MTC中的哪一个蛋白与H3K36me3结合呢？作者敲低了METTL14，发现MTC与H3K36me3的互作被削弱，但METTL3和WTAP的敲低基本无影响（下图k）；在不存在METTL14的情况下，SETD2敲低对m6A减少的影响被大大削弱（下图l）。体外pull-down和凝胶位移实验揭示，H3K36me3与重组METTL14蛋白之间存在直接相互作用（下图b，e，f）。所以，MTC蛋白中，METTL14与H3K36me3相结合。



   


为了确定METTL14与H3K36me3的结合位点，作者构建了METTL14的不同截短物。IP实验结果表明，在这些截短物中，Δ186–456是可以与H3K36me3相互作用的最短变异体（下图8g，h），氨基酸138-143和153-161对结合非常重要（下图8i）。不过，只有全长METTL14才能恢复METTL14敲除细胞中的m6A丰度（下图8j）。








作者研究了METTL14与RNA结合的情况，CLIP-seq表明METTL14有5,981个潜在RNA结合位点（下图m）。距离分析表明，METTL14的RNA结合位点与H3K36me3和m6A修饰重叠（下图f，g），这确认了METTL14介导了H3K36me3与m6A修饰。




我们知道，RNA聚合酶Pol II转录polyA RNA。作者发现，m6A MTC蛋白与Pol II相结合（下图h）。METTL14与H3K36me3和Pol II共定位于细胞核（下图p），表明H3K36me3对m6A修饰为共转录调控。





作者发现，从染色质新转录的RNA m6A修饰程度高于核质与胞质中的RNA（下图q）。为了理解该过程，作者用Pol II抑制剂5,6-dichlorobenzimidazole-1-β-d-ribofuranoside（DRB）处理了细胞。DRB处理降低了m6A的丰度，但不影响H3K36me3（下图r，s，t）。值得注意的是，DRB处理并未中断METTL14与H3K36me3，染色质或METTL3的相互作用（下图u）。这表明METTL14与H3K36me3的互作与Pol II无关。






H3K36me3通过调控m6A修饰影响干细胞分化
m6A修饰的动态调节对于胚胎干（embryonic stem，ES）细胞的自我更新和分化至关重要。为了确定H3K36me3对m6A RNA修饰的调控是否影响细胞分化，作者构建了强力霉素（doxycycline，Dox）诱导的SETD2敲低小鼠ES细胞模型。
SETD2敲低后，小鼠ES细胞表达了更高水平的多能性因子，例如OCT4（也称为POU5F1），SOX2和NANOG（下图a），而细胞分化的内胚层标记物（即GATA4，GATA6，DAB2和SOX7）的表达被减弱（下图d），这都表明细胞处于初始状态。SETD2敲低与METTL14敲低效果相似（下图g）。
 


SETD2敲低的小鼠ES细胞中，多能性因子的m6A修饰水平和H3K36me3的结合水平都下降了（下图e，o）。这些基因在分化过程中表达量显著下降，但能通过敲低SETD2部分挽救（下图p），而过表达METTL14则能部分挽救SETD2敲低所引起的分化抑制作用（下图f）。


以上研究表明，SETD2和H3K36me3通过对几个关键多能性基因的m6A修饰，抑制小鼠ES细胞多能性并促进其分化。

综上，作者提出以下模型（下图h）：m6A MTC的重要组成部分METTL14，直接读取H3K36me3（与Pol II无关），在Pol II介导的转录延伸过程中，m6A MTC甲基化新转录的RNA。


总结

这篇论文读下来，有一种淋漓畅快的感觉，剥丝抽茧，逐层推进，逻辑严密。通过翔实而细致的实验，作者首次从全基因组和转录组角度，揭示了m6A对RNA以及修饰位点集中在stop codons附近的选择决定机制，阐明了富集于stop codon附近的组蛋白H3K36me3通过招募METTL14，介导了MTC对新转录RNA m6A修饰，证实表观遗传组与表观转录组之间存在密切关联，为表观遗传领域的研究开辟了新的战场。