肝细胞性肝癌（HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，预后不良，致死率高。由于对该病症复杂的致病机制了解不足，肝癌的复发和转移往往难以避免。前期研究发现，表观调控，包括RNA m6A甲基化修饰在内，是肝癌癌变的关键性标志，且m6A修饰调控广泛参与到肝细胞性肝癌的发生发展，甲基转移酶METTL14、METTL3、WTAP及其去甲基化酶FTO都与HCC致病有着紧密关系，但去甲基化酶ALKBH5介导的m6A修饰在HCC中是否发挥作用，此前还没有报道。
我们知道，m6A修饰是真核生物mRNA中最为普遍的甲基化修饰，该修饰调控有以下三类蛋白参与：

1. 甲基转移酶：METTL3、METTL14、WTAP等；
2. 去甲基化酶：FTO、ALKBH5等；
3. 甲基化阅读蛋白：YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、IGF2BP1/2/3等；

近期发表在Molecular Cancer上的论文要研究的问题，就是去甲基化酶ALKBH5介导的m6A修饰是否参与HCC的致病进程；如果是，那么ALKBH5调控的下游关键靶标是什么？
为了解决这个问题，作者进行了以下探索：

1. HCC中的去甲基化酶ALKBH5是否异常表达？
2. ALKBH5在HCC中发挥的作用？
3. HCC中去甲基化酶ALKBH5介导m6A修饰调控的关键靶标鉴定；
4. 去甲基化酶ALKBH5介导m6A修饰对目的基因的调控机制研究；
5. 去甲基化酶ALKBH5介导m6A修饰对目的基因的调控是否与表型相关？

 

1. HCC中的去甲基化酶ALKBH5是否异常表达？

为了探究HCC癌组织中的去甲基化酶ALKBH5是否异常表达，作者通过qPCR、WB检测了癌、癌旁组织中ALKBH5在转录、蛋白水平的表达状况（图1A-B），结果显示相较于癌旁组织，癌组织中的ALKBH5表达均显著下调。

图1

那么癌组织中ALKBH5下调是否与HCC癌症复发、转移相关？
研究发现，ALKBH5低表达的HCC患者无论是总生存率、还是无复发生存率，都更小（图1F），且ALKBH5表达降低是HCC患者生存率降低的独立预后因素（图1G）。

图1

上述结果表明，ALKBH5在HCC中发挥着重要作用。
 

1. ALKBH5在HCC中发挥的作用？

既然ALKBH5在HCC中有着重要作用，那ALKBH5如何影响HCC的复发或转移呢？作者在肝癌细胞中分别敲低、过表达了ALKBH5，并随之检测其增殖能力。CCK8和克隆形成实验表明，敲低ALKBH5增强了细胞的增殖能力，而ALKBH5过表达细胞的表型与之相反（图2A）。体外的EdU细胞增殖检测结果也证实了这一点（图2B-E），ALKBH5在体外可以抑制细胞生长。




图2

为了进一步阐明ALKBH5在HCC中的作用，作者利用皮下肿瘤模型进行了体内实验（图2F-G）。相较于对照组，ALKBH5敲低小鼠体内的肿瘤体积增大、重量增加，而ALKBH5过表达小鼠表型与之相反。这表明，不论是体内或是体外，ALKBH5均可抑制肿瘤生长。


图2

除此之外，作者也检测了ALKBH5对癌细胞的迁移及侵袭能力的影响。体外的transwell assays表明，敲低ALKBH5的细胞迁移及侵袭能力得以增强，而ALKBH5过表达细胞迁移、侵袭能力削弱（图3A）；伤口愈合实验结果也与之一致（图3B），这些都表明ALKBH5在体外能抑制癌细胞迁移。


图3

为了阐明体内ALKBH5对HCC转移的作用，作者将ALKBH5过表达、阴性对照组的HCCLM3-luc细胞经尾静脉注射入小鼠体内后，进行生物发光成像；ALKBH5抑制了HCC于小鼠体内转移的能力，呈现更低的荧光素酶活性和更少的肺转移灶（图3E-F）；HE染色（图3G）结果也证实了这一点。所以，ALKBH5于体外可抑制癌细胞迁移、侵袭，于体内可抑制肝癌细胞的转移。


图3
 

1. HCC中去甲基化酶ALKBH5介导m6A修饰调控的关键靶标鉴定；

ALKBH5的功能之一是RNA去甲基化，那么它是否是通过去甲基化影响癌细胞的表型呢？作者首先通过dot blot assays检测了细胞中m6A的总体水平（图4A），同预期一致，ALKBH5缺失使得细胞中m6A修饰的总体水平上升，而ALKBH5过表达细胞中m6A修饰总体水平明显下降。


图4

为了找出依赖于ALKBH5抑制HCC癌细胞转移的具体机制，作者针对ALKBH5过表达和载体转染的HCCLM3细胞，分别进行了meRIP-seq和RNA-seq（图4B）；在ALKBH5过表达细胞中，meRIP-seq鉴定到1538个m6A水平降低的差异peak（对应1344个转录本），RNA-seq鉴定到481个显著下调的转录本。
通过meRIP-seq和RNA-seq的联合分析，作者选择了在ALKBH5过表达细胞中m6A修饰水平下降、表达也下调的60个基因进行后续的研究。为了进一步缩小范围，找到关键的靶标基因，作者选取了top  10基因进行验证（图4C）。


图4

qPCR结果显示，上述10个基因中只有LYPD1始终与ALKBH5负相关（图4G）；WB结果也证实了这一点（图4H）。因此LYPD1可能是ALKBH5直接调控的靶标。


图4
 

1. 去甲基化酶ALKBH5介导m6A修饰对目的基因的调控机制研究；

MeRIP-seq显示，LYPD1的3’UTR有m6A peak，但ALKBH5过表达后，该峰明显降低（图5A）。为了证实这一结果，作者做了ALKBH RIP实验（图5B），发现ALKBH5蛋白可以富集到LYPD1 RNA，这意味着LYPD1在与ALKBH5相互作用后，可能在RNA水平上受到其调控；为了验证这一推测，作者进行了以下实验证明，ALKBH5负调控LYPD1的RNA水平：
meRIP-qPCR结果也表明（图5C），LYPD1 RNA上的m6A修饰发生在3’UTR区，且ALKBH5敲低后，LYPD1上的m6A修饰水平增强；


图5

作者做了荧光素酶的报告实验（图5D）。在荧光素酶报告基因前插入LYPD1-3’UTR序列或突变体（m6A修饰位点中的A被突变为C），当ALKBH5沉默后，转染LYPD1-WT质粒的细胞荧光素酶活性显著上升，而转染LYPD1-Mut质粒的细胞荧光素酶活性无明显变化；ALKBH5过表达的表型与之相反（图5E）。
ALKBH5敲低后，LYPD1 RNA的降解速度更慢，表明ALKBH5可降低LYPD1 RNA的稳定性（图5F）。
上述结果表明，ALKBH5可与靶基因LYPD1 RNA的3’UTR互作，并负调控LYPD1 RNA的稳定性。


   
图5

 

1. 去甲基化酶ALKBH5介导m6A修饰对目的基因的调控是否与表型相关？

为了阐明LYPD1在HCC中的作用，作者在细胞系中敲低了LYPD1，并随之检测细胞增殖、迁移及侵袭能力。CCK8和克隆形成实验、EdU检测表明（图6A-D），敲低LYPD1的细胞增殖能力减弱；transwell assays表明（图6E-F），敲低LYPD1后细胞的迁移、侵袭能力减弱。


图6

而为了探究LYPD1在体内所发挥的作用，对裸鼠进行了皮下肿瘤实验（图6G, H），同预期一致，LYPD1的敲低可以抑制异种移植瘤的生长。
此外作者通过生物信息学分析探究了LYPD1的临床相关性，TCGA、GEO等数据库中数据表明，同正常组织相比，HCC癌组织中的LYPD1表达上调（图6I）；且LYPD1表达高的患者的总生存率及无进展生存率都更低（图6J）。以上结果表明，HCC发展过程中LYPD1被激活，为促癌基因。



图6

敲低LYPD1的细胞表型与敲低ALKBH5的表型恰好相反，这已初步证明，癌症表型的发生是由ALKBH5调控的LYPD1所致。为了进一步证明上述表型是由ALKBH5-LYPD1带来的，作者做了挽救实验。CCK8和克隆形成实验表明，ALKBH5敲低细胞增殖能力变强的表型，在沉默LYPD1后被逆转（图7A-D）；不仅如此，敲低LYPD1同样能抑制ALKBH5敲低细胞的迁移、侵袭能力增强的表型（图7E-H）。综上，LYPD1的功能可能同ALKBH5所介导的HCC细胞增殖、转移的现象有关。


图7

为了进一步探究HCC癌组织中ALKBH5、LYPD1表达间的相关性，作者对这两个蛋白进行了IHC染色，在ALKBH5表达较低的标本中，约有62.2%的标本LYPD1染色较强，而在高表达ALKBH5的细胞中，近66.7%的细胞LYPD1染色较弱（图8A-B）；此外，两个独立的GEO数据集也显示，ALKBH5同LYPD1的RNA表达呈负相关（图8C）。


图8

 

1. 寻找在HCC转移、增殖中发挥作用的reader

此前研究发现，m6A甲基阅读蛋白（reader）对m6A修饰基因的调控发挥重要作用，那么是否有reader蛋白参与上述过程中呢？
此前已有报道YTHDFs和IGF2BPs家族的reader参与调控RNA稳定性，因此作者分别敲除了这些reader蛋白，并检测其中LYPD1的表达状况，结果显示只有敲低IGF2BP1后，LYPD1的表达显著下调（图9G）。


图9

为了进一步验证IGF2BP1是否参与上述过程，作者通过RIP实验，证明了IGF2BP1蛋白与LYPD1 RNA间存在互作（图9H）。此外，研究发现敲低IGF2BP1能挽救ALKBH5缺失所带来的LYPD1上调的表型（图9I）。上述结果证明，LYPD1受到ALKBH5介导的m6A修饰调控，并被IGF2BP1所识别，增强其RNA稳定性。


图9


综上，ALKBH5介导的m6A修饰通过调控LYPD1的表达，影响HCC的病程进展。同正常组织相比，HCC癌组织中的ALKBH5表达下调，使得LYPD1的m6A修饰水平升高，而这一修饰随之被IGF2BP1识别，并增强其RNA稳定性，LYPD1得以积累，促进了癌细胞的增殖及迁移能力，从而有助于HCC的发生（如下图）。




我们将文章思路总结于下图中。这篇论文的研究路线和实验方法都很经典，值得广大研究m6A修饰表观调控机制的学者参考借鉴。



参考文献：
Chen, Y., Zhao, Y., Chen, J., Peng, C., Zhang, Y., Tong, R., Cheng, Q., Yang, B., Feng, X., Lu, Y., Xie, H., Zhou, L., Wu, J., & Zheng, S. (2020). ALKBH5 suppresses malignancy of hepatocellular carcinoma via m6A-guided epigenetic inhibition of LYPD1. Molecular cancer, 19(1), 123. https://doi.org/10.1186/s12943-020-01239-w