研究背景

膀胱癌（Bladder cancer，BC）是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤。约25%的膀胱癌被诊断为肌肉浸润性膀胱癌，其中有一半的肌肉浸润性膀胱癌患者会发生远端转移。近几十年，该疾病的发病率和死亡率持续升高。然而，调节BC进展和转移的确切机制尚不清楚。因此，探讨调节BC侵袭转移的生物学和分子机制对改善BC的诊断和治疗至关重要。
circRNA与癌症之间的关系已成为癌症研究领域的一个重点，数百个circRNA已被证明在各种癌症中异常表达，但在BC中异常表达的circRNA的潜在机制和生物学功能尚不清楚。接下来，就让小编带大家来看看我们康测协助老师在这一问题上所做的研究吧。

研究结果
  前期研究发现，与正常组织相比，由FNDC3B的2、3号外显子形成的circ0001361在BC组织中上调。作者通过qRT-PCR评估了69例不同阶段的临床BC组织及其相应邻近的正常膀胱粘膜组织中circ0001361的表达。BC组织中的circ0001361的表达显著上调（下图F），Kaplan-Meier生存率分析显示circ0001361高表达的患者整体生存率较低（下图G）。与这些发现一致的是，侵袭性BC细胞系（EJ，T24T和UMUC3）的circ0001361表达明显高于非侵袭性BC细胞系（5637、RT4）和正常的尿路上皮细胞（SV-HUC-1）（下图H）。RNA荧光原位杂交（FISH）分析发现circ0001361主要位于细胞质中（下图I）。所以，Circ0001361在BC组织和细胞系中表达上调，暗示该circRNA在膀胱癌中发挥重要作用。




  为研究circ0001361在膀胱癌中的侵袭和转移作用，作者通过细胞划痕实验、Transwell实验和基质胶侵袭实验发现，沉默circ0001361，BC细胞的迁移和侵袭均受到抑制（下图B、C）；过表达circ0001361则显著促进了BC细胞的迁移和入侵（下图E、F）。CCK8、EdU和细胞周期检测显示，circ0001361的沉默或过表达对细胞增殖和细胞周期无明显影响。为了研究circ0001361在体内对BC转移的影响，作者通过尾静脉注射，在UMUC3细胞中敲除circ0001361，建立裸鼠肺转移模型。7周后，生物发光成像和H&E染色显示，敲除circ0001361可显著降低肺转移病灶的数量（下图G、H）。以上研究表明circ0001361能在体外和体内促进BC细胞的侵袭和转移，但不影响细胞增殖或细胞周期进展。










  之后作者通过UID mRNA-seq筛选circ0001361促进细胞侵袭和转移的下游靶点，发现只有MMP9同时在T24T细胞和UMUC3细胞中上调表达（下图B）。qRT-PCR结果显示MMP9在过表达circ0001361的T24T和UMUC3细胞中显著上调表达，在沉默circ0001361的细胞中显著下调表达。作者通过Western blot检测一系列与BC侵袭相关的蛋白，发现在circ0001361过表达的细胞中，MMP9蛋白水平明显上调；在circ0001361缺失的细胞中，MMP9蛋白水平下调，而其他蛋白水平没有明显变化（下图E、F）。为了探讨circ0001361对体内MMP9表达的影响，作者通过qRT-PCR检测肺转移性结节中MMP9的mRNA水平，结果显示，与对照组相比，circ0001361沉默组中MMP9的表达水平下降（下图G）；免疫组化(IHC)分析显示，沉默circ0001361可降低BC型肺转移瘤中MMP9蛋白的表达（下图H）。



为了进一步验证MMP9是circ0001361的主要下游效应器，作者对细胞的迁移和侵袭能力进行检测，MMP9的过表达可以显著挽救敲除circ0001361对细胞迁移和侵袭的抑制效果（下图A）。这表明MMP9的确介导了circ0001361诱导癌细胞的侵袭和转移。


  接下来，作者通过双荧光素酶报告发现circ0001361的过表达或敲低可以分别增加或降低MMP9 3’UTR报告的荧光素酶活性，而MMP9启动子及其5’UTR的荧光素酶活性没有显著变化（下图A、B）。这表明circ0001361能够通过调节MMP9 3’UTR活性促进MMP9的表达。鉴于miRNA在调节mRNA 3’UTR活性中的重要作用，作者通过TargetScan数据库和RNAhybrid软件分别预测MMP9结合的miRNA和circ0001361的靶向miRNA，共获得4个可以直接结合MMP9 3’UTR区的miRNA（下图C）。



用circ0001361做RNA pull-down，显示在T24T和UMUC3细胞系中，只有miR-491-5p与circ0001361显著结合（下图F）。经预测分析，circ0001361序列上有两个与可能结合miR-491-5p的位点。为了确定可能结合位点是否具有功能，作者在circ0001361过表达载体中分别突变这两个位点（下图G），结果表明，位点1突变，或位点1和位点2同时突变后，miR-491-5p结合显著降低；仅结合位点2突变时未观察到这种效应（下图H）。这表明，位点1对于circ0001361与miR-491-5p的结合至关重要。另外，RNA pull-down显示，与突变型miR-491-5p相比，野生型miR-491-5p富集circ0001361的程度更高（下图I），说明circ0001361直接结合miR-491-5p。




  接下来作者过表达miR-491-5p，发现MMP9的mRNA和蛋白质水平明显下调，过表达circ0001361则可以挽救这种现象（下图C、D）。双荧光素酶报告实验显示，miR-491-5p可直接与MMP9 3’UTR结合抑制其活性（下图E）。Transwell实验和侵袭实验则显示，过表达miR-491-5p可以显著抑制BC细胞的迁移和侵袭，而circ0001361的过表达可以挽救这种现象。综上所述，circ0001361作为miR-491-5p的海绵，正调节MMP9的表达，促进癌细胞迁移和侵袭。









研究结论

作者在前期研究结果中发现，circ0001361能够促进BC细胞的侵袭和转移，通过UID mRNA-seq（武汉康测科技）确定了其下游靶基因MMP9，再通过软件预测、RNA pull down等确定circRNA直接结合的靶miRNA；最后通过侵袭实验、Transwell等实验确定circ0001361作为miR-491-5p的分子海绵上调MMP9基因的表达并促进细胞侵入。这篇论文展示了circRNA ceRNA机制研究的经典思路，小伙伴们快学起来吧！


参考文献
Feng Liu, Hui Zhang, Fei Xie, Dan Tao, Xingyuan Xiao, Chao Huang, Miao Wang, Chaohui Gu, Xiaoping Zhang, Guosong Jiang. Hsa_circ_0001361 promotes bladder cancer invasion and metastasis through miR-491-5p/MMP9 axis. Oncogene (2020)