• 研究背景

m6A甲基化修饰作为最为普遍的RNA修饰之一，人们对其在真核生物中扮演的角色已有一定了解，但这一修饰是否在RNA病毒侵染过程中发挥作用还知之甚少。在病毒侵染后，病毒的核酸会激活宿主先天防御反应，使其产生I型干扰素、促炎细胞因子和趋化因子，以限制病毒的复制和传播。而病毒的RNA结构及其转录后修饰，都是宿主识别“自我”和“非我”RNA的关键因素。那么病毒上的m6A修饰又能否影响宿主对它的识别呢？
本研究所关注的科学问题，就是探究病毒RNA上的m6A修饰是否影响病毒对宿主的侵染过程。若m6A修饰在此过程中发挥作用，究竟是促进侵染、还是抑制侵染？其具体的调控机制又是怎样的？
  作者以人偏肺病毒（hMPV）这一单股负链RNA病毒为模型，探索m6A修饰是否在hMPV侵染的过程中发挥作用。该病毒mRNA的产生如下图所示，负链的基因组RNA可直接转录出mRNA，也可先产生互补配对的反基因组RNA，再产生互补的负链基因组RNA，最后转录出mRNA。


作者首先对纯化的hMPV病毒total RNA进行了m6A-seq（剔除rRNA的方式富集RNA），发现病毒的基因组、反基因组上均有m6A修饰（下图a）。



为了了解病毒mRNA上的m6A修饰状况，作者对hMPV侵染的细胞也进行了m6A-seq（polyA捕获的方式富集RNA），结果显示hMPV的mRNA上存在m6A修饰，且mRNA上发生m6A修饰的区域与其反基因组上发生m6A修饰的区域高度重合（下图b）。


  既然hMPV上存在m6A修饰，那么这一修饰在病毒侵染宿主的这一过程中发挥了什么作用呢？。
m6A修饰被相应的甲基化阅读蛋白识别后，影响下游靶标的转录、翻译等过程，因此作者在A549细胞系中分别瞬时表达多个甲基化阅读蛋白(YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3, and YTHDC1)，甲基化阅读蛋白超表达后，病毒G、N蛋白的表达显著上调（下图c），病毒粒子的释放也明显增多（下图d）。HeLa细胞系中稳定超表达上述甲基化阅读蛋白的结果也与之一致。这些结果初步表明，m6A修饰对病毒侵染宿主有促进作用。



为了更进一步验证上述结果，作者又超表达了甲基化转移酶(METTL3, METTL14)，甲基化转移酶的过表达同样有助于hMPV的复制（下图f）及其G、N蛋白表达（下图g）；而敲除去甲基化酶(ALKBH5, FTO)的效果是一样的。这些结果再次表明，m6A修饰有助于hMPV的复制、有助于病毒侵染宿主。



此外，作者还发现hMPV的N蛋白同宿主的甲基化酶METTL14存在共定位（下图h），而N蛋白是核糖核蛋白的组分，在病毒复制中发挥重要作用。


  为了继续验证m6A修饰在病毒侵染中所发挥的作用，作者将病毒基因组、反基因组及mRNA上潜在的m6A修饰位点进行了同义突变，得到6个rhMPV突变体：rhMPV-G1-2, G1-7, G8-9, G8-14, G1-14和rhMPV-G(-)1-6，且通过meRIP定量发现，这些rhMPV突变体上的m6A修饰水平显著下降（下图b）。此外，rhMPV-G1-14和rhMPV-G8-14突变体反基因组RNA与甲基化阅读蛋白YTHDF1, YTHDF2的结合能力也大幅下降（下图c）。



不仅如此，这些具m6A缺陷的rhMPV突变体产生的免疫斑点更小（下图a），病毒的复制存在缺陷（下图b），其N、G蛋白的表达量也更低（下图c）。这些都表明，hMPV病毒的m6A缺陷抑制了病毒在宿主细胞中增殖。





作者通过mRNA-seq发现，在hMPV侵染后，先天免疫相关基因显著上调（下图c）,且m6A缺陷的突变体病毒侵染宿主细胞（A549, THP-1）时，细胞分泌的干扰素（IFN-I）明显增多（下图d, f）。




m6A缺陷的突变体病毒引发宿主更高水平IFN-I，究竟是hMPV病毒基因组，反基因组，还是其mRNA的m6A修饰在上述过程中发挥了关键作用呢？作者先提取了被病毒侵染细胞的总RNA并用其转染细胞，相较于对照组rhMPV而言，rhMPV-G1-14和rhMPV-G8-14突变体能引发更高水平的IFN（下图i），且当经小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理后(CIP可使RNA去磷酸化)，不再产生IFN。而当用病毒的mRNA转染宿主时，仅能引发和阴性对照相当的IFN水平（下图j），表明是hMPV病毒基因组、反基因组——而非mRNA——上的m6A修饰缺乏，引发了更高水平的IFN。



随后，作者直接用纯化的病毒RNA转染细胞，各m6A缺陷的突变体均能引发较高的IFN水平，rhMPV-G1-14突变体引发的IFN水平最高（下图l）。这也印证了之前的结论，hMPV病毒基因组、反基因组上m6A修饰缺陷引发了更高水平的IFN。


  究竟是哪些RNA传感器检测m6A缺陷病毒的RNA呢？作者测量了已知的RNA传感器MDA5, RIG-I及衔接蛋白MAVS敲除细胞受病毒侵染时的IFN水平，结果发现，在野生型细胞中，rhMPV-G8-14和rhMPV-G1-14突变体引发的IFN-β水平比rhMPV高得多（下图a），MDA5敲除细胞的表型也与野生型细胞一致（下图b），但当RIG-I或MAVS被敲除后，不论是rhMPV-G8-14, rhMPV-G1-14突变体还是rhMPV，均不引发IFN-β的产生（下图c, d）。





用病毒RNA转染细胞，表型也与病毒侵染的结果一致：在野生细胞、MDA5敲除细胞中，rhMPV-G8-14, rhMPV-G1-14突变体引发的IFN-β显著上调（下图e, f），但当RIG-I或MAVS被敲除后，rhMPV-G8-14, rhMPV-G1-14突变体引发的IFN-β与rhMPV较为接近（下图g, h）。这些都表明RIG-I在检测m6A缺陷病毒并激活IFN-I产生中发挥重要作用。



接下来作者发现，不论是用rhMPV-G8-14, rhMPV-G1-14突变体病毒侵染细胞（下图a），还是用rhMPV-G8-14, rhMPV-G1-14突变体的RNA转染细胞（下图b），细胞中RIG-I的蛋白表达均显著上调。



不过，当病毒RNA经CIP酶处理后再转染细胞时，RIG-I的表达不上调（下图d）。上述结果表明，具m6A缺陷的RNA可促进RIG-I的表达，且这种促进表达的作用依赖于病毒RNA 5’端的三磷酸。
为了研究I型IFN相关的信号级联是否被激活，作者检测了hMPV病毒侵染（下图e）或病毒RNA转染（上图d）的细胞，发现在各m6A缺陷的突变体病毒侵染下，细胞中IRF3蛋白S386, S396的磷酸化水平明显上调；而用CIP处理病毒的RNA转染细胞后，其IRF3不再发生磷酸化。这些表明，m6A缺陷hMPV病毒可引发更高水平的IRF3磷酸化，进而引发下游IFN-I的分泌。



4.1 RIG-I更易结合具m6A缺陷的病毒
既然m6A缺陷的hMPV病毒使得宿主中RIG-I表达上调，那么这些病毒的侵染是否会改变病毒RNA与RIG-I的结合能力呢？作者利用生物素标记的病毒RNA结合RIG-I发现，rhMPV-G8-14, rhMPV-G1-14突变体病毒的RNA与RIG-I蛋白的亲和力更高（下图a）；Flag标记的RIG-I蛋白拉病毒RNA，结果也表明RIG-I蛋白结合了更多rhMPV-G8-14, rhMPV-G1-14病毒反基因组（下图c）。这些实验均证明，具m6A缺陷的病毒RNA与RIG-I蛋白的亲和力更强。



体内的RNA竞争结合实验结论一致：随着rhMPV-G1-14突变体RNA的增多，结合的RIG-I蛋白也随之增多（下图e）。


4.2 m6A缺陷的病毒RNA使RIG-I蛋白的构象发生变化
作者猜测m6A缺陷的hMPV病毒会使RIG-I蛋白的构象发生变化，从而激活下游IFN表达。为了验证这一猜想，作者用胰蛋白酶对RIG-I:RNA复合物进行酶解。当无配体RNA存在时，经胰蛋白酶处理的RIG-I（107kDa）产生了55 kDa的肽段(helicase domain) （下图h）；而当双链RNA类似物poly(I:C)存在时，经胰蛋白酶处理RIG-I 会产生80 kDa的肽段(CARD-Helicase domain)（下图i）。当野生型病毒RNA处理时，RIG-I酶解产生几乎不产生80 kDa的肽段，而rhMPV-G8-14, rhMPV-G1-14病毒RNA存在时，RIG-I经胰蛋白酶酶解产生更多80 kDa的肽段（下图j）。竞争实验也表明，随着rhMPV-G1-14病毒RNA的增多，RIG-I在胰蛋白酶处理下产生的80 kDa的肽段更多（下图k）。
这些结果表明，m6A修饰阻碍了RIG-I蛋白对病毒RNA的识别，而m6A缺陷的hMPV能与RIG-I蛋白结合，并改变了蛋白构象（下图g）。



综上，hMPV病毒RNA 5’端的三磷酸是RIG-I结合所必需的；m6A修饰降低RNA传感器RIG-I蛋白的亲和力，而m6A缺陷病毒能使RIG-I蛋白构象改变，使下游IFN的表达增强。
  为了更好的证实RIG-I蛋白可以识别hMPV病毒RNA，作者进行了挽救实验：rhMPV-G1-14和rhMPV-G8-14突变体病毒在野生型细胞中出现严重的生长缺陷（下图a）；而在RIG-I（下图c）或MAVS（下图d）敲除细胞中，rhMPV-G1-14突变体的生长可恢复至野生型相当水平，尽管早期复制有所延迟，rhMPV-G8-14突变体的生长也有部分恢复；相反，rhMPV-G1-14和rhMPV-G8-14突变体在MDA5敲除细胞中的生长能力同在野生型细胞中类似，并无显著变化（下图b）。这些进一步证实，RIG-I而非MDA5可识别具m6A缺陷的hMPV病毒RNA，并抑制了缺陷病毒的复制。




  体内实验也证明，m6A缺陷的hMPV病毒可使细胞产生更多的IFN：在棉鼠鼻腔中接种hMPV病毒，并对其支气管肺泡进行灌洗发现，接种有PBS或rhMPV病毒的棉鼠体内IFN-β低于检测水平，而接种有rhMPV-G1-14、rhMPV-G8-14突变体病毒的棉鼠体内IFN-β分别为150.2、175.3 U/ml（下图e）。这一体内实验也表明，m6A缺陷的hMPV病毒可使宿主产生更多的IFN。



不论是棉鼠肺部还是鼻甲中，rhMPV-G1-2、rhMPV-G8-9、rhMPV-G1-14突变体的复制均受到抑制（下图f）。不仅如此，突变体病毒造成的肺部损伤更少（下图g）。这些结果表明，m6A缺陷hMPV病毒在棉鼠体内的复制能力明显降低，且致病力也被大幅削弱。





那么m6A缺陷hMPV病毒是否还具有免疫原性呢？实验表明，不论接种的是野生型hMPV病毒还是m6A缺陷hMPV病毒，再次接种病毒均可保护宿主，抑制病毒的复制（下图h）。此外，在接种2周时，m6A缺陷的hMPV病毒能使棉鼠产生更高水平的抗体（下图i）。这表明，m6A缺陷的hMPV病毒的免疫原性与野生型病毒相当，甚至更高，可保护宿主免受后续的hMPV病毒感染。




综上所述，本研究得到以下模型：hMPV病毒基因组或反基因组上的m6A修饰可助其“伪装”成宿主自身的RNA，逃逸宿主的识别，助其感染宿主；而m6A缺陷的hMPV的RNA会被宿主的RNA传感器RIG-I识别，并激活一系列先天免疫的信号通路，引发高水平的IFN产生，阻止病毒的复制和感染。此外，病毒RNA的m6A修饰可作为减活hMPV的潜在靶点，用于疫苗的研制。



参考文献：
[1] Lu M ,  Zhang Z ,  Xue M , et al. N6-methyladenosine modification enables viral RNA to escape recognition by RNA sensor RIG-I[J]. Nature Microbiology, 2020, 5(4):1-15.