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植物中m6A阅读蛋白通过调控polyA位点选择影响硝酸盐代谢
人阅读 发布时间：2021-09-26 14:27
- 研究背景
本研究要解决的科学问题，就是探究拟南芥中潜在的甲基化阅读蛋白CPSF30-L是否同m6A修饰有关？若有关，CPSF30-L所介导的m6A调控的具体分子机制又是怎样的？一起来看看与康测合作的老师做的漂亮研究吧。
- CPSF30-L是拟南芥的甲基化阅读蛋白
此前研究发现含YTH domain的Reader可以结合具m6A修饰的RNA（5’ -RGACH- 3’
motif），为了探究CPSF30-L是否是真正的Reader，作者通过等温滴定量热（ITC）实验进行了探究，发现CPSF30-L与具m6A修饰的RNA有很高的亲和力，而与无m6A修饰的RNA亲和力仅为前者的十分之一（下图B），暗示CPSF30-L确实是Reader。
作者接着对CPSF30-L-m6A RNA复合体进行了共结晶并解析其结构（下图C），与其他具YTH domain的Reader蛋白类似，发生甲基化修饰的腺嘌呤（A）可插入CPSF30-L的疏水口袋中（下图D）。而这一疏水口袋具三个保守的氨基酸残基：Trp310, Trp259, 以及Tyr319，除此之外，Ala260, Asn249, Thr261, Asp356等残基也在识别甲基化核酸的过程中发挥重要作用，且这些氨基酸残基在不同物种中保守存在（下图E）。YTH domain(CPSF30-L)-m6A RNA分子间的相互作用也表明CPSF30-L的确是Reader（下图F）。为了更好的证实这一结论，作者将识别CPSF30-L中识别m6A修饰的关键氨基酸参基进行了突变（Trp310, Trp259, Tyr319→Ala310, Ala259, Ala319），突变后的蛋白与具m6A修饰RNA的亲和力大幅下降（上图B）。这些结果表明，CPSF30-L是真正的m6A reader。
- CPSF30-L调控全局polyA位点的选择
不仅如此，由于m6A修饰可影响包括polyA位点选择在内的mRNA加工过程，而CPSF30-L不仅是m6A Reader，还可大范围调控APA发生，因此作者怀疑CPSF30-L可能是通过识别m6A修饰调控APA。为了验证这一猜测，作者对野生型、cpsf30-2突变体拟南芥进行了meRIP-seq，检测其中的m6A修饰情况，meRIP、PAS-seq联合分析发现，存在m6A修饰的RNA在突变体中更容易发生APA（下图D），且cpsf30-2突变体的polyA位点距m6A修饰更远（下图E, F）。上述结果表明，CPSF30-L介导的APA依赖于其m6A识别能力。
- CPSF30-L通过影响APA调控硝酸盐代谢相关基因
为了验证这一推测，作者选择了硝酸盐信号相关通路中的几个基因（NRT1.1, WRKY1, GLN1;1, GLN1;3）进行验证，这些基因的RNA上均存在m6A修饰，且均可使用不同的polyA位点（下图A, C, E, G），不仅如此，上述RNA在cpsf30-2突变体中表达量发生了明显改变（NRT1.1, WRKY1显著下调，而GLN1;1, GLN1;3显著上调），但回补CPSF30-L蛋白可使突变体中靶标RNA的表达量恢复至野生型水平（下图B, D, F, H）。
此外，作者还进行了生理实验，通过NRP-YFP拟南芥响应外界硝酸盐时根部会发荧光的特点，来验证CPSF30-L蛋白的作用：将幼苗用硝酸盐培养基培养5天后，cpsf30-2突变体根部的荧光明显低于野生型，在突变体中回补CPSF30-L可使其荧光强度恢复至野生型水平，而回补丧失m6A识别能力的CPSF30-L蛋白(W259A, W310A, Y319A)的拟南芥荧光强度仍远低于野生型（下图A, B）。
而硝酸盐响应通路的改变，使cpsf30-2突变体硝酸盐含量大幅降低，硝酸盐还原酶活力、氨基酸含量显著增加，而在突变体中回补CPSF30-L，可使上述表型恢复至野生型水平，但回补丧失m6A识别能力的蛋白（W259A, W310A, Y319A），植株表型仍同突变体类似（下图C, D, E）。这些结果均表明，CPSF30-L的 m6A识别能力可介导APA的发生，从而调控硝酸盐信号通路中的靶标RNA。
综上，作者发现拟南芥中的蛋白CPSF30-L是m6A Reader，该蛋白的m6A甲基化修饰的识别能力，可介导APA的发生，进而调控硝酸盐代谢相关的靶标RNA表达，从而影响拟南芥的氮素代谢过程。
研究思路小节：
- 生信预测、蛋白结构解析及ITC等证实CPSF30-L为m6A reader；
- PAS-seq+meRIP-seq、RT-qPCR证明CPSF30-L的m6A识别能力可介导靶标RNA polyA位点的选择；
- 生理实验等表明CPSF30-L可调控硝酸盐代谢相关的靶标RNA表达，从而影响拟南芥的氮素代谢过程。
参考文献：
[1] Hou Y , Sun J , Wu B , et al. CPSF30-L-mediated recognition of mRNA m6A modification controls alternative polyadenylation of nitrate signaling-related gene transcripts in Arabidopsis[J]. Molecular Plant, 2021, 14(4).
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