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铜也能促癌：铜转运蛋白1（CTR1）激活PDK1-AKT致癌通路
人阅读 发布时间：2021-09-26 14:56
研究背景
金属离子已被证实在人体发育、酶的激活和代谢平衡中发挥着关键作用。因此，金属离子平衡异常导致了大量的人类疾病，包括神经退行性疾病和癌症等。此前研究表明，铜离子能通过促进肿瘤血管生成促进肿瘤的发生。
磷酸肌苷3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（PKB，也称AKT）通路的过度激活存在于人类各种疾病（包括糖尿病和癌症）中，PI3K-AKT信号通路的基因突变包括了PIK3CA、RAS和AKT的突变，而PTEN、NF1和VHL的缺失/功能缺失突变都可能导致肿瘤发生。
最近，肿瘤微环境的变化，如缺氧（hypoxia）或活性氧（ROS）胁迫影响，也能通过不同的机制激活AKT。然而，金属离子影响AKT激酶活性和致癌功能的生理作用并没有完全确定。2021年7月18日，中山大学郭剑平联合哈佛医学院魏文毅（Wenyi Wei）研究团队，在Advanced Science上在线发表了题为“Copper Promotes Tumorigenesis by Activating the PDK1-AKT Oncogenic Pathway in a Copper Transporter 1 Dependent Manner”的研究论文，揭示了铜能激活PI3K-AKT致癌信号通路，促进肿瘤的发生。接下来，就让小编带大家来看看我们康测协助老师在这一问题上所做的研究吧。
研究结果
1. CTR1-铜通路对AKT激酶的激活起到了重要作用
作者首先测试了不同金属离子对肿瘤发生相关的重要信号通路——PI3K-AKT信号通路中的关键组分AKT激酶活性的影响，发现铜离子通过磷酸化AKT激酶的Thr308和Ser473位点激活AKT激酶活性（下图a）。利用铜离子螯合剂TTM（下图b）以及在MEFs细胞系中敲除CTR1（下图c & d），进一步证明了铜离子通过CTR1蛋白转运进而激活AKT激酶。
作者利用UMI mRNA-seq，证明CTR1敲除细胞的差异表达基因在PI3K-AKT信号通路上有极显著的富集（下图e~g），进一步说明CTR1-铜通路对AKT激酶的激活起到了重要作用。
此后作者通过shRNA的方法敲低CTR1，结果表明，在不同癌细胞系中敲低CTR1均能显著减弱AKT的磷酸化水平（下图h）；用四环素诱导已敲低CTR1的DLD1细胞系表达突变失活的CTR1（M154A）和野生型CTR1，发现失活CTR1（M154A）的细胞中磷酸化AKT激酶的水平显著低于野生型（下图i），同时CTR1（M154A）细胞系的增殖能力也显著减弱（下图j）。
综上所述，CTR1-铜通路对AKT激酶的激活起到了重要作用。
2.铜与PDK1结合
那么，铜离子是如何激活AKT激酶的呢？作者尝试探究铜离子激活AKT激酶的分子机制。基于此前AKT激酶上游的PI3K-PDK1信号通路研究，作者首先利用抑制剂LY294002抑制PI3K激酶活性，AKT的磷酸化水平显著降低（下图a），暗示铜离子对AKT的激活依赖于PI3K-PDK1信号通路。
所以，作者检测了不同金属离子与PDK1的结合情况，通过pulldown实验发现，PDK1可以与铜特异性结合（下图b、c）。为了进一步证明CTR1-Cu是PDK1-AKT信号通路的主要调控分子，作者检测了不同金属离子作用下PDK1-AKT的结合水平，发现在pulldown PDK1后，仅在铜离子处理条件下可以检测到AKT1，且利用铜离子螯合剂TTM可以抑制PDK1与AKT的结合（下图d、e）。以上证据进一步表明铜离子可以通过增强PDK1与AKT的相互作用来激活AKT激酶。
3.铜与PDK1的结合的主要位点是H117和H203
在证明铜可以与PDK1结合后，作者希望能进一步寻找到铜与PDK1的具体作用位点。为此作者构建了大量突变体，并结合质谱的方法，鉴定到H117和H203两个位点。之后，作者首先将这两个结合位点突变为A，基于免疫共沉淀（IP）结果，作者发现PDK1的双突变与AKT1的结合力显著减弱（下图f），AKT激酶的pT308及pS473的磷酸化水平也显著降低（下图g）。作者又在敲除了PDK1的DLD1细胞系中进行了相似实验，结果同前——PDK1双突变对AKT的激活显著降低（下图h、i），充分证明了铜与PDK1的结合的主要位点是H117和H203。
利用PDK敲除的DLD1细胞系，发现其中的双突变细胞系（2A）的定殖能力减弱（下图k），肿瘤移植至小鼠后的体积减小（下图l）、质量降低（下图m）。同时，PDK1双突变对Cisplatin化疗处理表现敏感，其细胞存活率显著降低（下图n）。与此结果类似，铜螯合剂TTM可以显著降低野生型细胞的存活率，而在PDK1双突细胞系中则没有明显变化（下图o、p）。以上结果表明铜/PDK1对于促进AKT激酶活性及致癌功能起到了重要作用。
4. CTR1-铜通路通过激活AKT激酶表现其致癌功能
以上一系列发现表明了铜离子通过CTR1激活AKT激酶导致肿瘤发生，但CTR1在正常细胞中也大量存在，且主要调控着铜离子的转运；同时CTR1在肿瘤中表达异常升高的机制并不清楚。
基于以上疑问，作者首先检测了不同乳腺癌细胞系中CTR1的表达（下图a，星号代表TNBC：Triple-negative breast cancer三阴性乳腺癌细胞系），发现在TNBC中，CTR1表达量相对更高；不同乳腺癌组织中CTR1表达量显著高于普通乳腺组织（下图b、c）。乳腺癌患者的数据表明，CTR1表达量与存活率负相关，表明CTR1可能作为乳腺癌诊断的标志基因（下图d）。
此后作者继续研究CTR1激活AKT激酶的致癌功能。shCTR1的细胞系敲低AKT1后，其增殖能力显著降低，而相对于CTR1正常表达的细胞系敲低AKT1后，其增殖能力没有发生明显改变（下图e、f）。过表达AKT1后，细胞增殖能力均有一定程度上升（下图g、h）。以上结果表明CTR1-Cu通路通过激活AKT激酶发挥其致癌功能。
5. Nedd4l通过泛素化降解CTR1
作者发掘了TCGA数据库，发现在癌组织中CTR1的表达量升高，这一结果暗示CTR1的表达或受到转录后调控。此前研究报道，酵母中CTR1能够被Rps5泛素化降解，该E3泛素酶在人类中同源蛋白Nedd4共有9个家族成员。基于这些信息，作者试图找到Nedd4家族中特异性调控CTR1的泛素酶。于是，作者首先在蛋白酶抑制剂MG132条件下对这些泛素酶进行检测，发现Nedd4l和WWP1可以与CTR1互作（下图a）。通过过表达Nedd4l及其突变体Nedd4l（C962A），确定Nedd4l可以泛素化修饰CTR1，该互作过程的关键位点为C962（下图b）。在BT549细胞系中过表达Nedd4l和C962A，野生型Nedd4l过表达后未经修饰的CTR1减少，进一步证明了Nedd4l可以泛素化修饰CTR1（下图c）。
多个细胞系敲低Nedd4l后，观察到CTR1的蛋白水平显著升高（下图e）。在蛋白合成抑制剂作用下，敲低Nedd4l还能延长CTR1的半衰期（下图f、g）。临床上，作者观察到癌组织Nedd4l的表达相对于癌旁组织降低，而Nedd4l的降低与CTR1的表达呈负相关（下图h、i）。以上证明，Nedd4l是CTR1的E3泛素酶。
6. Nedd4l通过抑制CTR1-AKT信号通路来有效抑制肿瘤发生
通过发掘TCGA数据库，作者发现Nedd4l的表达水平与乳腺癌发病率呈正相关（下图a），侧面印证了Nedd4l负调控CTR1。在多个细胞系中，观察到敲低Nedd4l后，CTR1蛋白水平上升（下图b），同时细胞增殖能力增强（下图c）。移植肿瘤到小鼠上，发现敲低Nedd4l促进了肿瘤的生长（下图d、e、f）。
作者进一步发现，敲低Nedd4l可以增强磷酸化水平（下图g、h）。而且，敲低CTR1可以显著减弱因敲低Nedd4l而增强的AKT激酶磷酸化以及细胞增殖能力（下图i、j）。进一步在AKT1激酶突变细胞中敲低Nedd4l，癌细胞的增殖能力有一定程度的上升（下图k、l）。
这些结果证明，Nedd4l通过抑制CTR1-AKT信号通路抑制肿瘤发生。
研究结论
该研究通过对金属离子的筛选，发现铜离子可以通过铜转运体CTR1激活AKT激酶。并从机制上证明铜可以结合PDK1，促进其与AKT的相互作用，并依赖PI3K激活AKT的促癌信号通路。通过敲除铜转运体CTR1或使用铜螯合剂，可以减少AKT信号，以降低肿瘤的发生。CTR1在乳腺癌中异常升高，并受到泛素酶Nedd4l的负调控。因此，Nedd4l通过抑制CTR1-AKT信号通路表现出肿瘤抑制功能。
总之，这些发现共同证明了Nedd4l-CTR1信号通路以铜-PDK1结合的方式对AKT激酶实现精细调节，并强调了通过靶向CTR1-铜通路打击AKT驱动的癌症的潜在策略。值得一提的是康测科技的UMI分子标签转录组测序分析，为证明基因敲除细胞中差异表达基因富集到作者关注的PI3K-AKT信号通路提供了准确可靠的转录组测序证据，相应思路可以应用到各种经典信号通路课题的研究中！
参考文献
Guo J, Cheng J, Zheng N, et al. Copper Promotes Tumorigenesis by Activating the PDK1‐AKT Oncogenic Pathway in a Copper Transporter 1 Dependent Manner. Advanced Science, 2021: 2004303.
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