研究背景

精子发生是指精子干细胞在睾丸生精上皮内分化成精子的过程，它由三个阶段组成：有丝分裂（精原细胞的增殖和分化）阶段、减数分裂（精母细胞分化）阶段和单倍体（也称为精子发生，圆形精子分化成精子）阶段。精子发生的独特之处在于转录本的整体缩短和延迟翻译：粗线期以后转录本变短，储存在核糖核蛋白颗粒 (RNP) 中，直到需要时在伸长的精子细胞中进行翻译。RNA变短可能与可变剪接的增加或某些RNA降解机制有关，而RNP颗粒则可以保护一些特殊的mRNA避免被降解，以维持一些重要蛋白的表达。

转录后修饰m6A在生物领域已得到广泛研究，其对于mRNA分子的成熟、稳定、翻译等具有重要作用。最新研究表明，某些环状RNA具有编码潜力，可以在果蝇、小鼠和人类中翻译为蛋白质。但是关于m6A与circRNA的关系一直以来都没有相关报道。大多数由编码基因反向剪接形成的circRNA包含开放阅读框（ORF）结构，具有蛋白编码能力。但是，关于含有ORF的circRNA的发生机制，以及它们是否真的被转化成蛋白质，在特定的生理环境下具体发挥了什么作用等问题，现在仍不清楚。接下来，小编就带大家来浏览一篇关于m6A修饰与circRNA生成有关的文章。

研究结果 研究表明，在精子发生过程中，mRNA转录本的缩短是通过选择性使用多聚腺苷酸化信号和选择性降解具有较长3’UTR的转录本来实现的。作者对精子发生时期的三种精原细胞类型（粗线期细胞、圆形期细胞、精子延长阶段细胞）进行circRNA-seq，发现随着精子发生的进展，circRNA 的数量（图 1a）和相对丰度（图 1b左）都急剧增加，相应线性RNA水平下降（图 1b右）。而circRNA 水平高表达可能导致了某些特别重要的转录本在精子发生的后期被保留用于生产蛋白质。

图1
  作者通过RNA-seq发现，随着精子发生的进展，m6A去甲基化酶ALKBH5的mRNA水平下降（图2a左），而敲除ALKBH5的睾丸组织中发现的 circRNAs 远比对照组中的多（图2a右），说明m6A 水平和circRNA生物发生之间可能有一定联系。为了进一步证实ALKBH5影响circRNA的表达，作者通过体外敲低ALKBH5 和minigene reporter assays实验（mRNA异常剪接体外验证）发现，ALKBH5水平降低时，circRNA的水平急剧上调，而对应线性RNA的水平不受影响，表明抑制ALKBH5确实能增强circRNA表达。

图2

为了进一步研究circRNA的产生与m6A水平之间的关系，作者通过m6A-seq分析（图2b）发现，从粗线期精母细胞到圆形、长形的精母细胞，circRNA剪接位点在终止密码子附近越来越丰富，与同一区域附近m6A水平的增加密切相关（图2c），说明m6A水平升高和circRNA水平之间正相关。通过分析circRNA的丰度和m6A水平，发现circRNA的含量越丰富，它们所包含的m6A水平就越高，于是作者推测circRNAs是从富集m6a的位点剪接出来的。为验证这一猜想，作者对m6A-seq 结果进行circRNA注释，发现从粗线期精母细胞到圆形、长形的精母细胞，环状/线性RNA的比例逐渐升高，且m6A-seq结果中的环状/线性RNA比率显著高于RNA-seq结果中的比率（图2d），表明 circRNA 的连接区域显著富集了m6A位点。

图2
  进一步分析发现，在精子发生时积累的circRNA主要来自外显子（图3a），而这些circRNA的剪接位点富含起始密码子和终止密码子（图3b），说明这些环状RNA可能包含全长或部分ORF。meRIP-seq分析发现，在起始密码子周围存在m6A修饰（图3e）。而m6A 修饰的起始密码子可以被 YTHDF3 识别并充当翻译起始的IRES（内部核糖体进入位点序列），从而被翻译成蛋白。如果这些circRNA可被翻译，就意味着尽管线性RNA降解，含有ORF的circRNA也可以取代它们，维持连续的蛋白质生产。

图3
  之后，通过观察circRNA的丰度，作者发现当圆形精子细胞发育成长型精子细胞时，圆形精子细胞中富含RNP的circRNA被释放出来，与核糖体结合，而对应的线性RNA 则逐渐被降解（图4a）。

图4
  作者发现，ALKBH5敲除的小鼠，在精子发生过程中，circRNA的丰度一直很高；而在野生型小鼠中，circRNA的丰度是随着精子发生的进展逐步升高的（图5a）。而且，在ALKBH5敲除的小鼠生精细胞中，相关的circRNA比野生型的表现出更高的m6A水平（图5d）。METTL3敲除的小鼠中则相反（图5g）。

图5
  作者发现精原细胞中circRNA的含量是精母细胞和精子细胞的50-100倍，精原细胞中胞浆小滴（cytoplasmic droplets）也发现含有大量的circRNA分子（图6a）。GO分析显示胞浆小滴中的circRNA来源基因主要参与了精子运动和精子能量代谢，而成熟的精子中circRNA的来源基因主要参与组蛋白修饰等（图6b）。之后作者还分析了整个精子和精子头部的circRNA含量，发现整个精子中circRNA的数量是精子头部的三倍，说明circRNA主要定位于精子的尾部和颈部（图6c）。作者还发现，年轻小鼠的精子中含有更多的circRNA（图6d）。精子中30-50%的circRNA在多个物种中是保守的（图6g）。在人的精子细胞中，作者发现，高生育能力精子比低生育能力精子含有更多的circRNA（图6f）。



图6
  精细胞中circRNA携带了m6A修饰，且可以结合核糖体，因此作者合理推测这些circRNA能够被翻译。为进一步验证circRNA可以进行翻译，作者首先为circRNA编码的肽定制了数据库（图7a）。之后，通过蛋白质组学技术液质联用LC-MS，将鉴定到的肽和数据库进行比对，发现假阳性率较低。而且，RNA-seq注释的circRNA的counts数和LC-MS鉴定的肽数是高度正相关（图7c），进一步说明这些肽不是随机降解产物，而是从circRNA翻译而来。

图7

总结
本文不仅报道了m6A修饰在编码circRNA的新作用，而且发现了即使在没有线性mRNA的情况下，通过产生ORF中含有m6A修饰起始密码子的circRNA，也能够确保稳定和持久的蛋白表达。接下来我们再来回顾一下文章的整体思路：
1）作者通过circRNA-seq发现在小鼠精子发生过程中，粗线期精母细胞发育成圆形细胞，进而拉长为精子细胞时会生成大量circRNA。
2）circRNA的反向剪接主要发生在m6A富集位点，而这些位点通常位于线性mRNA的起始和终止密码子附近。
3）这类circRNA多数携带较长的ORF，这些ORF的起始密码子被m6A修饰，可能有蛋白编码潜能。
4）利用LC-MS鉴定了数百个由这类circRNA编码的多肽，将鉴定到的肽段和数据库进行比对，发现假阳性率较低，进一步说明了circRNA被翻译。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41422-020-0279-8