结直肠癌（CRC）常向远端转移且复发率高，是目前致死率最高的恶性肿瘤之一，因此亟需进一步探索致病机制，从而寻找新的诊断生物标志物和有效治疗靶点。另一方面，越来越多的研究发现，m6A修饰及其相关的调控蛋白在多种恶性肿瘤的致病进程中发挥着重要作用，然而，m6A修饰及相关的调控蛋白是否在CRC中发挥着某种生物功能，这个问题还不清楚。
我们知道，m6A修饰是真核生物mRNA中最为普遍的甲基化修饰，该修饰调控有以下三类蛋白参与：

• 甲基转移酶：METTL3、METTL14、WTAP等；
• 去甲基化酶：FTO、ALKBH5等；
• 甲基化阅读蛋白：YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、IGF2BP1/2/3等；

近期发表在Molecular Cancer上的论文，想探究甲基转移酶METTL14介导的m6A修饰是否参与CRC的致病进程；如果是，那么METTL14调控的下游关键靶标是什么？ 为了了解CRC组织中METTL14的表达状况，作者从TCGA（下图a）、GEO（下图b）数据库中检索了METTL14的表达状况，发现癌组织中METTL14 mRNA水平远低于癌旁组织。



此后，作者对136例结直肠癌患者的癌组织、癌旁组织进行了qRT-PCR及IHC验证（下图c,d），结果与数据库中一致，癌组织中METTL14的表达明显降低。



METTL14的低表达是否与CRC的致病进程有着某种联系呢？为了探究这一问题，作者接着进行了Kaplan-Meier生存分析，结果表明METTL14低表达的CRC患者总生存率(OS)较差（下图e）。不仅如此，METTL14的表达是OS的独立预后因素（下图f）。因此，癌组织中的METTL14低表达很可能与CRC的致病进程有着紧密联系。


  CRC中METTL14低表达机制是什么？作者又在ENCODE数据库中查找了H3K4me3的ChIP-seq数据，发现CRC中METTL14启动子部位的H3K4me3修饰大幅降低（下图a）。


而据此前研究，KDM5C可介导H3K4me2/3的去甲基化，并抑制基因的转录，因此作者也关注了CRC中KDM5C的表达状况。与癌组织中的METTL14低表达相反，KDM5C的表达明显升高，暗示KDM5C与METTL14的表达负相关。
为了验证这一猜想，作者用KDM5C抑制剂处理了结直肠癌细胞系，经抑制剂处理后的细胞中METTL14的mRNA、蛋白水平均升高（下图b, c），敲低KDM5C的结果也一样（下图e）。




之后作者通过ChIP查看METTL14启动子区KDM5C的结合状况及H3K4me3的修饰水平，结果表明KDM5C的敲除增加了METTL14启动子区的H3K4me3修饰（下图f, g）。
综上，CRC中的KDM5C高表达，介导METTL14启动子区的H3K4me3修饰降低，从而抑制了METTL14表达。 METTL14是如何影响CRC的进展呢？作者在细胞系中分别敲除、过表达了METTL14，并检测了细胞的迁移、侵袭能力（下图c, d），METTL14过表达抑制了CRC细胞的迁移、侵袭能力，而敲除METTL14则促进了其迁移、侵袭能力。此外，体内实验也表明，METTL14的过表达使肺转移病灶减少，表明CRC细胞转移能力受到抑制（下图f），而敲除METTL14的表型与之相反（下图e）。上述结果证明，METTL14表达与CRC的进展的确存在紧密联系，METTL14的表达可抑制CRC细胞迁移和侵袭。

为了进一步探究METTL14抑制CRC发展的机制，作者对对照组和METTL14敲低的细胞进行了RNA-seq及meRIP-seq，通过两个高通量测序的联合分析，得到25个潜在靶标（下图a）。而由于此前已知SOX4与肿瘤的发生有着密切联系，因此作者选择了SOX4作为后续研究的重点。在METTL14敲低的细胞中，SOX4的mRNA、蛋白表达均明显升高（下图b, c）。不仅如此，meRIP-seq也显示，SOX4的终止密码子区存在m6A peak，而当METTL14被敲除后，上述区域的m6A修饰大幅降低（下图d）。

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临床情况是否与细胞实验相符呢？TCGA数据库中SOX4的表达情况也表明，癌组织中SOX4的mRNA水平远高于癌旁组织（下图e），且qRT-PCR和IHC实验的结果也与之一致（下图f, g），这些结果初步表明，METTL14与SOX4的表达呈负相关，可能是METTL14介导的m6A修饰靶向SOX4造成的。

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为了进一步确认SOX4是METTLE14调控的下游靶标，作者还进行了meRIP-qPCR，当METTL14过表达时，细胞中SOX4 mRNA上的m6A修饰大幅增加，而敲低METTL14则导致SOX4的m6A修饰减少（下图b）。荧光素酶实验发现，当报告系统中含有可被修饰的GGAC序列时，敲低METTL14可抑制荧光强度；而当腺嘌呤被突变后，敲低METTL14并不影响荧光强度，表明METTL14介导的m6A修饰影响了SOX4的表达（下图c, d）。上述结果证明，METTL14介导的m6A修饰靶向下游的SOX4，使SOX4表达水平下降。

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由于m6A修饰通常需要甲基阅读蛋白的读取，且m6A的调控通常是通过甲基阅读蛋白实现的，那么是哪个reader识别了SOX4上的m6A修饰呢？。作者分别敲低了YTHDF1/2/3（下图e），只有在敲低YTHDF2时，SOX4的表达大幅升高（下图f）。METTL14敲低使SOX4 pre-RNA和成熟的mRNA表达明显升高（下图g），那么SOX4的表达上调是否是YTHDF2识别m6A修饰所带来的呢？作者检测了SOX4 pre-RNA和成熟mRNA的稳定性，通过放线菌.素D处理细胞阻断转录，发现METTL14敲低后，SOX4 pre-RNA和成熟的mRNA的半衰期延长（下图h, i），表明m6A修饰可促进SOX4的降解。而RIP-seq表明YTHDF2可特异结合SOX4 mRNA（下图j）。综上，敲低METTL14减少了SOX4上m6A修饰，YTHDF2识别m6A修饰后可维持mRNA稳定性。

在确认METTL14靶向修饰SOX4后，这一靶标是否在CRC致病进程中发挥重要作用呢？为了进一步确认SOX4是否为关键靶标，作者敲除了SOX4并检测细胞的迁移、侵袭能力，发现敲低SOX4降低了癌细胞的迁移、侵袭能力（下图a, b, c）。体内实验也表明，SOX4敲低后，小鼠的肺转移灶减少（下图g）。




之前已发现METTL14与SOX4的表达负相关，过表达METTL14可抑制SOX4的表达，抑制细胞的迁移、侵袭；作者同时过表达METTL14和SOX4发现，SOX4过表达可以挽救因METTL14过表达而下降的细胞迁移、侵袭能力（下图d, e, f），且体内实验结果也与之一致，过表达SOX4使METTL14过表达小鼠体内的肺转移灶数目恢复至对照组水平（下图h）。上述结果表明，SOX4的确为METTL14下游的关键靶标，其表达可促进CRC的致病进程。 前期研究发现，SOX4可调控上皮细胞间充质转化（EMT），而这一生物学过程与肿瘤细胞的迁移、侵袭能力密切相关。作者发现METTL14被敲除后，细胞呈现EMT的主要特征，如N-钙黏蛋白、波形纤维蛋白表达升高，而E-钙黏蛋白的表达大幅下降，这表明METTL14敲除促进了EMT的发生；而同时敲除SOX4可逆转上述现象，恢复表型（下图a）。

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另外，有报道SOX4可激活MAPK, PI3K-Akt和Wnt信号通路，作者也检测了相关通路标志蛋白的表达状况：METTL14敲低促进PI3K和Akt蛋白的磷酸化，这表明METTL14敲低激活了PI3K/Akt信号通路；再敲低SOX4可去磷酸化（下图b）。这些结果表明，METTL14通过靶向修饰SOX4，影响了EMT过程和PI3K/Akt信号通路，抑制CRC进展。

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综上，文章得到一个CRC病程进展模型：结直肠癌组织中，KDM5C表达上调，使METTL14启动子区域的H3K4me3去甲基化，从而抑制了METTL14的转录；而METTL14的低表达使得靶标SOX4 mRNA上的m6A修饰减少，YTHDF2无法识别未修饰位点，不能介导SOX4降解，SOX4 mRNA稳定性升高，表达量上调；SOX4上调后，一方面促进EMT过程，另一方面激活PI3K/Akt信号通路，增强了癌细胞的迁移、侵袭能力，最终促进了CRC的病程进展。 这篇文献大体思路仍是m6A研究的经典思路，但作者在此基础上，还研究了上游组蛋白修饰对m6A相关蛋白（METTL14）的调控，给文章带来了新意。因此，m6A文章结合其他调控模式或许能更好的揭示调控机制，并获得更多的关注。

参考文献：Chen, Xiaoxiang et al. “METTL14-mediated N6-methyladenosine modification of SOX4 mRNA inhibits tumor metastasis in colorectal cancer.” Molecular cancer vol. 19,1 106. 17 Jun. 2020, doi:10.1186/s12943-020-01220-7