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工程化外泌体修复受损细胞内吞作用并减轻椎间盘退变
1993 人阅读发布时间：2021-11-25 10:38
研究背景
椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）是引起下腰痛的主要原因，开发IDD的有效治疗措施是椎间盘研究中的焦点之一。干细胞治疗是实现组织修复的重要手段之一。
外泌体(EVs)是间充质干细胞 (MSC) 治疗肌肉骨骼退行性疾病——包括椎间盘退变——的潜在治疗方式。通常，EVs被内化，传递生物活性分子，使受体细胞发生表型变化。为了在 IDD 治疗中有效利用EVs，了解EVs摄取的机制至关重要。
2021年9月，华中科技大学同济医学院附属协和医院杨操教授团队在《ACS Nano》上发表研究论文“Engineering Extracellular Vesicles Restore the Impaired Cellular Uptake and Attenuate Intervertebral Disc Degeneration”，该项研究探索了干细胞来源外泌体被髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPCs）内吞的机制及其在椎间盘退变治疗中的应用。康测的转录组测序帮助老师验证了一个重要假设哦，让我们一起先睹为快吧~~
研究结果
1. MSC共培养系统改善TNF-α处理的NPCs细胞焦亡
作者首先利用TNF-α处理NPCs，如下图A所示，作者通过WB检测了焦亡标志蛋白在50 ng/mL TNF-α处理下不同时间点的表达量，发现其中的cleaved caspase-1 (C-caspase-1)和GSDMD-N及NLRP3蛋白表达量相对对照组显著增加，且与处理时间正相关。
为了进一步研究MSCs对NPCs的治疗作用，作者构建了如下图B所示的细胞间接接触共培养模型。通过该共培养系统，作者检测到MSCs共培养可显著降低NPCs中C-caspase-1、GSDMD-N和NLRP3的表达，且随着共培养时间的增加，这种治疗效果更加明显。同时，如下图D和E所示，免疫荧光分析表明MSC共培养组的细胞焦亡率也显著降低，且与共培养时间呈反比。
随后，作者使用特异性抑制外泌体分泌试剂GW4869处理MSCs，如下图F所示，焦亡相关蛋白表达量升高，确定抑制外泌体分泌会破坏MSCs在NPCs中共培养的治疗效果。同时，如图G和H所示，免疫荧光分析也显示GW4869处理增加了共培养组NPCs细胞焦亡率。
以上结果表明，外泌体可能介导了MSC共培养的治疗效果，但其具体机制仍有待进一步研究。
2. MSC来源的外泌体可抑制TNF-α诱导的NPCs细胞焦亡。
为了确认EVs的效果，作者将EVs从MSC培养基中分离后孵育NPCs，与对照组（PBS或不含EV的培养基（CM）培养的NPCs）相比，EVs处理组降低了TNF-α处理的NPCs中C-caspase-1、GSDMD-N和NLRP3的表达（下图A），免疫荧光分析也同样发现与EVs孵育显著降低NPCs的细胞焦亡率（下图B）。
此外，作者发现TNF-α处理的NPCs中，Peroxiredoxin-2 （Prx2，过氧化物酶2）的表达水平降低，而在添加EVs培养时则显著升高（下图D），说明Prx2被输送到NPCs中。
为了进一步研究Prx2的作用，作者利用siRNA敲低改基因，WB检测发现EVs-si-Prx2组中C-caspase-1、GSDMD-N、NLRP3的表达水平高于EVs-si-scr组（下图E和F），免疫荧光分析也显示，EVs-si-Prx2处理组相比EVs-si-scr组，NPCs细胞焦亡率显著升高（下图G和H）。
这些结果表明Prx2在EV介导的治疗效果中发挥作用，同时EVs中Prx2水平的降低一定程度上影响了NPCs的治疗效果。
3. 降低NPCs中EVs的吸收对不利于治疗
经TNF-α预处理的NPCs与EVs孵育，发现EV孵育对焦亡相关蛋白的表达水平影响不大（下图A和B），流式细胞仪的检测结果也表明TNF-α-24h和TNF-α-36h组中标记的NPCs活率降低，表明EV吸收受损（下图C和D）。
这些发现表明，TNF-α处理降低了EVs吸收，不利于治疗。
4. 细胞吸收EVs依赖于Caveolae介导的内吞作用
为了阐明EVs吸收的机制，作者使用了不同的胞吞通路抑制剂处理NPCs。通过PKH-26标记EVs并与NPCs孵育后，流式细胞仪检测发现，加入氯丙嗪(chlorpromazine，可阻断网格蛋白介导的内吞作用)或青霉素 (wortmannin，磷酸肌苷3-激酶的抑制剂)对EVs的吸收几乎没有影响，而胆固醇合成动力蛋白抑制剂dynasore和辛伐他汀（simvastatin）的添加可显著降低NPCs对EVs的吸收（下图A和B）。
因此作者推测，caveolae/lipid可能参与了EV的内化过程。为了验证这一假设，作者利用RNA-seq，分析TNF-α处理不同时间点的NPCs的基因表达情况（下图C），如图D的GO富集分析显示差异下调基因与脂质代谢过程、肝素和糖胺聚糖结合相关，有力支持了作者此前提出的猜想。
基于RNA-seq结果，作者进一步进行EVs吸收的机制探究，发现在TNF-α处理的NPCs中，凹陷蛋白相关蛋白2（Caveolae associated protein 2，Cavin-2）的表达显著降低，co-IP分析结果表明，在NPCs中，Cavin-2与Caveolin-1结合(图F)。同时作者构建了敲低Cavin-2的NPCs (图E)，并利用流式细胞仪检测发现Cavin-2敲低显著降低EV吸收（下图G&H）。
这些结果表明，NPCs的EV吸收是由依赖caveolae的内吞作用介导的，而Cavin-2在这一过程中发挥了关键作用。
5. 改造EVs可使受损NPCs重新获得治疗效果
为了修复NPCs的内吞通路，作者利用基因编辑技术设计了改良的EVs，构建了Cavin-2表达载体，并将其转染到MSCs中（下图A）。
作者从对照MSCs (C-EVs)和转染Cavin-2的MSCs (M-EVs)中分离出EVs，如下图B和C所示，检测发现C-EVs和M-EVs的形态和尺寸分析无显著差异。WB检测细胞和EV部分的Cavin-2蛋白水平，表明Cavin-2在M-EVs中高表达（下图D）。
为了评估C-EVs和M-EVs对NPCs的影响，作者检测了TNF-α预处理的NPCs中细胞焦亡相关蛋白的水平（下图E），并利用免疫荧光（下图F）和流式细胞仪检测（下图G），进一步评估NPCs胞外细胞内吞作用的差异，表明M-EV组的内吞吸收率高于C-EV组。
这些结果表明，经Cavin-2工程改造的EVs能够恢复NPCs的细胞内吞作用的吸收功能，对受损NPCs具有更好的治疗效果。
6.改良EVs在三维水凝胶中恢复NPCs的囊泡吸收
作者构建了三维海藻酸水凝胶体外培养模型，模拟体内Cavin-2改造的EVs对NPCs的影响（下图A），利用该模型，作者发现在TNF-α受损的NPCs中对C-EVs和M-EVs的吸收率不同（下图B）。同时，基于标记EVs荧光强度分析，TNF-α未处理的NPCs中C-EVs和M-EVs的吸收率相似。而与M-EVs相比，TNF-α处理的NPCs对C-EVs的吸收显著减少（下图C）。
作者还在该模型中评估了EVs孵育的NPCs的细胞活力，与此前结果一致，TNF-α治疗可诱导NPCs死亡，C-EVs或M-EVs均可部分挽救TNF-α的效应。与C-EVs相比，M-EVs在TNF-α处理的NPCs上表现出较低的死亡率（下图G）。
综上所述，M-EVs能够恢复受损NPCs囊泡吸收能力。
7. EVs改造工程对体外椎间盘培养模型有治疗效果
作者研究了Cavin-2改造的EVs是否能够在椎间盘退变治疗中发挥作用。在离体椎间盘培养模型中，整个椎间盘器官被分离并在培养基中培养，这使得能够使用外部添加剂在器官水平上做检测（下图A）。作者一周内重复EV注射程序，体外成像显示C-EVs或M-EVs在椎间盘内留存超过一周（下图B）。
此前的研究发现，退变椎间盘的特征是髓核区域缩小、纤维环伴纤维破裂。作者通过苏木.精伊红(HE)和藏红花素O-fast green (S-O)染色观察大鼠椎间盘髓核和纤维环的形态和细胞稀疏性。对这些组织学染色结果量化后发现，TNF-α导致大鼠椎间盘的退行性病变，给药C-EVs或M-EVs可延缓IDD进展(图7F)。M-EVs对IDD的治疗效果优于C-EVs。TUNEL分析结果表明，与C-EVs相比，M-EVs更明显地降低了TNF-α诱导的细胞死亡(图7H)。
总之，这些数据表明，在体外模型中，工程改造的EVs具有更好的椎间盘退变治疗效果。
研究结论
本项研究发现，干细胞外泌体通过递送抗氧化蛋白可缓解髓核细胞焦亡，减缓细胞的损伤与退变。然而，细胞功能下降的髓核细胞对干细胞外泌体表现出较低的摄取效率，极大地影响了细胞外囊泡的治疗效率。进一步研究发现，Cavin-2在髓核细胞内吞外泌体的过程中发挥重要作用，Cavin-2的丢失导致髓核细胞对外泌体内吞效率降低。通过对母体干细胞改造，获得表达Cavin-2的工程化外泌体，此类囊泡可有效恢复髓核细胞对外泌体的摄取效率，提升此类细胞外囊泡在椎间盘退变中的治疗效果。该研究探索了髓核细胞对干细胞来源外泌体的吸收机制，并设计了内吞性能优化的工程化外泌体用于椎间盘退变的治疗，为细胞外囊泡在椎间盘损伤修复领域中的应用提供新的思路。
（A，炎症环境下髓核细胞（NPCs）内吞途径受损，对外泌体的吸收效率降低，致使外泌体治疗效率下降；B，工程化外泌体可改善髓核细胞的内吞活性，增加细胞对外泌体的细胞吸收量，进而提升外泌体在椎间盘退变中的应用效果）
参考文献
Liao Z, Liu H, Ma L, et al. Engineering Extracellular Vesicles Restore the Impaired Cellular Uptake and Attenuate Intervertebral Disc Degeneration[J]. ACS nano, 2021.