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胚胎干细胞中内源性逆转录酶和核糖核酸酶介导的抗病毒机制
人阅读 发布时间：2021-11-25 10:12
名词缩写和解释：
mESCs：小鼠胚胎干细胞
MEF：小鼠胚胎成纤维细胞
脑心肌炎病毒(EMCV)：一种在细胞质中复制的单链RNA病毒。
小鼠肝炎病毒(MHV)：属于冠状病毒科β冠状病毒属，单链RNA病毒。
内源性逆转录病毒(ERV)：在哺乳动物的基因组中，存在大量逆转录病毒序列，称为内源性逆转录病毒(ERV)，由逆转录病毒感染、病毒基因组逆转录和整合事件引起。
研究背景
基于核酸的防御系统在抗病毒过程中发挥着重要作用，例如，CRISPR/Cas采用RNA引导的DNA切割来防止DNA噬菌体感染，RNA干扰(RNAi)采用RNA引导的RNA切割来防御RNA病毒感染的。在哺乳动物细胞中，当面临病毒感染时，基于干扰素(IFN)的先天免疫提供了第一道保护。然而，早期胚胎和多能干细胞，包括胚胎干细胞(ESC)，在病毒感染期间产生的IFN有缺陷，并且它们对IFN治疗的反应也很弱。尽管如此，干细胞仍能抵抗病毒感染。因此，干细胞如何应对病毒感染是一个有趣且具有挑战性的问题。最近，有报道证明干扰素刺激基因 (ISG) 和RNAi通路与ESC抗病毒感染有关。 然而，通过敲除生产siRNA的Dicer酶，RNAi 缺陷干细胞对病毒感染的抵抗力反而更强了，这表明ESC中可能存在其他复杂的抗病毒机制。本研究报道了一种新型的基于核酸的抗病毒系统，在小鼠胚胎干细胞(mESCs)中，通过DNA介导的RNA切割来抑制RNA病毒感染。值得一提的是，文中单链DNA建库测序工作是康测协助完成的哦。快来跟随小编了解作者是如何一步步发现这个新的抗病毒机制的吧~
研究思路
1. 内源性 RTase 能够抑制 mESC 中的病毒感染
作者首先用脑心肌炎病毒（EMCV）感染mESC（E14TG2a和D3）和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) ，结果表明，与MEF相比，mESC细胞系对EMCV的感染更具抵抗力（图1a）。在mESC中观察到的RTase活性明显高于MEF和BHK21等体细胞（图 1b）。而mESCs在分化后几乎失去了RTase活性（图 1c）。
图1
接着，作者通过RTase抑制剂叠氮胸苷（AZT）来研究内源性逆转录病毒 ERV的RTase活性对mESC抗病毒免疫的影响。结果表明，AZT处理显著增加了EMCV的RNA和蛋白质水平（图2d，e；），并且还增加了受感染细胞的比例和病毒滴度（图 2f，g）。这说明AZT 处理显著增强了EMCV的细胞病变效应，表明RTase能显著影响mESC抗病毒功能。
图2
之后，作者进一步测试了AZT 对小鼠肝炎病毒 (MHV) 的影响，结果显示AZT处理能显著促进mESCs中的MHV增殖（图3k，l），表明内源性RTase的抗病毒功能也适用于其他RNA病毒。此外，作者通过LSD1（一种组蛋白H3赖氨酸4脱甲基酶，抑制MESCs和早期胚胎中ERV 的表达）抑制剂GSK-LSD1处理mESCs，结果表明，GSK-LSD1处理显著降低了mESC中EMCV的RNA、病毒蛋白和病毒滴度的水平（图 3h-j），而且MHV的感染也受到 GSK-LSD1处理的抑制（图 3k，l）。
综上，说明内源性 RTase能显著抑制mESC中RNA病毒的感染。
图3
2. 内源性RTase引起受感染mESC细胞质中产生病毒DNA
有报道表明，哺乳动物细胞中还存在非逆转录RNA病毒的DNA 形式。接下来，作者测试了mESC中的RTase活性是否引起EMCV感染后病毒DNA (vDNA)的合成。结果表明，感染后12小时就可以在mESC中检测到vDNA（图 4a）。此外，在病毒感染后，mESCs比MEF和BHK21等体细胞产生了更多的vDNA（图 4b），并且在mESCs分化后vDNA的水平显著降低（图 4c）。相应地，AZT处理有效地抑制了vDNA的产生（图 4d），而GSK-LSD1处理增加了vDNA水平（图 4e）。因此，作者推测vDNA的产生可能是mESC中RTase抗病毒功能的原因。随后，作者对vDNA进行了亚细胞定位（图4f)，DNA荧光原位杂交（DNA FISH）也证实了vDNA定位于细胞质（图 4g）。总的来说，这些结果表明，病毒感染后mESCs中的RTase可以使细胞质中的病毒RNA产生vDNA，这种vDNA可能限制了病毒复制。
图4
3. vDNA与病毒RNA形成 DNA/RNA异源双链
作者接下来通过处理只能切割双链DNA（dsDNA）的DNA限制性核酸内切酶BsrB1和Mfe1来研究vDNA的性质（图 5a）。结果表明，在限制性核酸内切酶处理后，含有EMCV基因组的质粒pCMV-rNJ08的PCR产物显著减少，而vDNA的PCR产物不受影响（图 5b）。 此外，vDNA对特异性消解ssDNA的S1核酸酶敏感（图 5c）。之后，作者通过使用正链或负链引物进行单向引物PCR延伸来确定vDNA相对于病毒基因组RNA链的极性。结果表明，在正链引物（p5-F和p6-F）延伸中，PCR 产物的数量显著减少（图 5d），这意味着dsDNA的形成。这些结果表明，vDNA主要由与病毒基因组RNA互补的负链ssDNA组成，命名为vcDNA。接着，作者用特定探针富集了vcDNA，并通过深度测序来分析研究vcDNA沿病毒基因组的分布。如图5e所示，vcDNA序列沿病毒基因组分布并不均匀，与基因组3'部分匹配的reads数更多。作者假设它可能以DNA/RNA（感染细胞中的病毒RNA）杂交的形式存在，之后通过特异性识别DNA/RNA杂交结构的单克隆S9.6抗体检测（图 5f），以及DNA-RNA免疫共沉淀 (DRIP) 实验（图5g、h）， 最终验证了vcDNA主要存在于DNA/RNA异源双链体中，与受感染mESC中的病毒RNA一起存在。
图5
4. RNase H1对未分化mESC中vcDNA的抗病毒功能至关重要
由于RNase H可识别和切割DNA/RNA杂交体中RNA，作者之后测试了内源性RNase H1是否参与了mESC中vcDNA的抗病毒功能。首先，作者发现受感染mESC中的DNA/RNA杂交体与细胞质中的RNase H1共定位（图 6a）；其次，使用RNAscope（一种高度灵敏的 RNA 原位杂交分析）确定了病毒RNA与细胞质中的RNase H1共定位（图6b）；第三，vcDNA可以被病毒感染的mESC中 RNase H1抗体免疫共沉淀（图 6c）。这些结果表明内源性RNase H1被vcDNA和病毒RNA形成的异源双链招募。
图6
接下来，在病毒感染前，作者通过siRNA敲低RNase H1的表达来评估RNase H1是否可以调控抗病毒感染。结果表明，RNase H1耗竭显著促进了mESC中EMCV和MHV的感染，但未影响ISG的表达（图7d-f）。为了进一步研究RTase和RNase H1介导的抗病毒过程之间的关系，作者在病毒感染前用AZT或GS K-LSD1处理了RNase H1耗尽的 mESC，AZT对RTase活性的抑制显著增强了病毒感染，并且在AZT处理后RNase H1敲低未能进一步促进病毒增殖，表明RNase H1在内源性RTase下游发挥功能（图7g，h)。相比之下，敲低RNase H1 可以部分消除GSK-LSD1的抑制效果（图7i，j）。此外，RNase H1的过表达抑制了病毒感染，而失去活性的RNase H1突变体对mESC中的病毒感染没有影响（图7k-m）。这些结果表明RNase H1参与了mESC中RNA病毒复制的限制机制，且处于内源性RTase的下游。
图7
总结
在这项研究中，作者揭示了mESC中以前未被表征过的抗病毒机制。病毒感染后，内源性RTase将病毒RNA逆转录为vcDNA，形成由vcDNA和病毒RNA组成的DNA/RNA杂交体。异源双链体招募RNase H1，后者水解杂交体中的病毒RNA从而抑制病毒复制。 作者将这种类型的抗病毒机制命名为ERASE（内源性RTase/RNase H介导的抗病毒系统），这意味着入侵的RNA病毒可以被ERASE擦除（图8a）。本研究结果首次证明，内源性RTase和RNase H组合通过产生与病毒基因组互补的vcDNA，在天然抗病毒防御中发挥作用切割病毒RNA。因此，ERASE代表了另一种基于核酸的抗病毒防御机制，是对已知抗病毒机制的补充（图8b）。
图8
内源性RTase和RNase H在防御mESC中RNA病毒感染的作用意味着源自病毒RNA的DNA可能具有抗病毒防御功能。本研究结果为mESCs的抗病毒机制以及内源性逆转录病毒和细胞RNase H的抗病毒功能提供了有趣的新洞见，也为研究RTases和逆转录元件在广泛生物体中的抗病毒功能提供了基础。
参考文献
Wu J, Wu C, Xing F, et al. Endogenous reverse transcriptase and RNase H-mediated antiviral mechanism in embryonic stem cells[J]. Cell Research.
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