研究背景
内生菌和植物共生现象在自然界中普遍存在，许多内生菌可以通过产生保护性代谢物和调节植物激素来增强植物免疫力以应对非生物胁迫或生物胁迫。然而，内生真菌与植物免疫系统相互作用的内在机制尚不完全清楚。本研究中，作者通过UMI Dual RNA-seq研究了核盘菌菌株DT-8（一种内生真菌）与其宿主油菜共生的机制。那么作者是如何通过Dual RNA-seq结合时下正火热的UMI技术（http://www.seqhealth.cn/list/10.html）来挖掘这一共生机制的呢？下面就让小编来带领大家一睹为快吧~

研究内容 首先，作者分别对核盘菌菌株DT-8（DT-8_Mock）和未感染DT-8的油菜籽（Rapeseed）萌发的植株作为对照组进行UMI RNA-seq，用DT-8感染后萌发的油菜植株（Rapeseed_DT-8）作为处理组进行UMI Dual RNA-seq，实验方案如图1所示。


图1

为了研究菌株DT-8定植对油菜籽产生的影响，作者将Rapeseed_DT-8和Rapeseed的测序结果进行了比较，鉴定到1082个差异基因（DEGs），其中1048个上调，34个下调。为了研究核盘菌的相对基因表达变化，将菌株DT-8定植油菜籽 (DT-8_Rapeseed) 时的基因表达数据与DT-8_Mock的基因表达数据进行比较。在 DT-8_Rapeseed中，共有1921个差异基因具有统计学意义，其中1015个上调，906下调。接下来，作者就通过对以上两部分差异基因进行功能分析来揭示其内在的共生机制。
  Rapeseed_DT-8上调表达的1048个基因中，有57个基因富集显著。KEGG富集分析显示，上调的油菜基因中22个显著富集于“苯丙.烷生物合成”和“芥子油苷生物合成”等与植物防御相关的途径中（表1）。这些结果表明，油菜籽被菌株DT-8感染后抗病性增加。有4个上调基因属于“戊糖和葡萄糖醛酸相互转化”途径，其中两个基因编码果胶酯酶，两个基因编码果胶酸裂解酶。油菜果胶酯酶和果胶裂解酶基因的上调表达可能导致细胞壁解体并促进核盘菌DT-8的定植。

表1：油菜中上调基因的KEGG富集分析
芸苔属植物可以产生许多针对病原体的吲哚-硫植物抗毒素，芸苔素相关β-葡糖苷酶（BABG）、二硫代氨基甲酸酯S-甲基转移酶（DTC-MT）和细胞色素P450家族71亚家族CR（CYP71CR）是将芥子油苷转化为异硫氰酸酯，然后将异硫氰酸酯转化为芸苔宁、螺芸苔宁和环芸苔宁这些植物抗毒素的三种关键酶。结果表明，除了BABG基因BnaA04g25750D、BnaC04g49660D 和 DTC-MT基因BnaCnng41630D，其余6个关键酶编码基因在Rapeseed_DT-8中均上调（图2）。该结果表明，当菌株DT-8定植油菜籽时，吲哚-硫植物抗毒素的合成被激活。


图2
  在植物与内生真菌之间的碳水化合物转运过程中，植物糖转运蛋白 (STs) 发挥着重要作用。菌株DT-8定植油菜籽时，油菜籽ST基因有6个上调，无下调（图3）。这些STs可能与DT-8菌株在油菜中的定植密切相关。


图3
  KEGG富集分析显示，上调的核盘菌基因共富集到14条途径（图 4a）。其中在淀粉和蔗糖代谢途径中共有24个基因，这些基因与木质纤维素、果胶代谢和淀粉酶合成有关，表明淀粉可能是菌株DT-8的重要营养素。对于下调的核盘菌基因，富集的途径与染色体复制有关，包括“同源重组”、“核苷酸切除修复”、“DNA 复制”、“错配修复”和“非同源末端连接” 。此外，“类固醇生物合成”也得到了富集（图4b）。该结果表明，当菌株DT-8定植油菜籽时，其生长和类固醇生物合成降低。


图4
  作者在核盘菌基因组中发现了43个ST基因，系统发育分析显示，大多数ST基因编码葡萄糖转运蛋白/己糖转运蛋白（图5a），糖转运蛋白是植物自身和其与真菌相互作用中碳分配的关键成分。17个上调的ST基因包含3个未分类的糖转运蛋白基因、3个纤维二糖转运蛋白基因、4个D-半乳糖醛酸转运蛋白基因、3个麦芽糖转运蛋白基因、1个戊糖转运蛋白基因、1个木糖转运蛋白基因和两个葡萄糖转运蛋白基因（图 5b）。6个下调的ST基因包含2个己糖转运蛋白基因、1个果糖转运蛋白基因、1个D-半乳糖醛酸转运蛋白基因、1个木糖转运蛋白基因和1个未分类的糖转运蛋白基因（图5c）。该结果表明，当菌株DT-8定植油菜籽时，糖转运蛋白可能发挥重要作用。


图5
  当定植油菜籽时，菌株DT-8中的Ss-Rhs1、SsITL、Ss-cum1、SsCP1和SsCVNH 上调（图6）。在核盘菌中，这些基因编码的分泌蛋白对菌株的毒力有重要影响，说明这些基因可能有助于菌株DT-8消除油菜籽激活防御反应的不利影响。


图6
  同时，作者研究了核盘菌植物细胞壁降解酶 (PCWDE) 基因的表达谱。发现当菌株DT-8定植油菜籽时，sspg6、ssxpg1、Endo2、sspg5、ssxpg2和sspg3上调（图7）。这些上调的PCWDE基因可能会促进菌株DT-8的定植。


图7
  低毒株DT-8定植油菜时，苹果酸合酶基因Ss-mls1、草酰乙酸乙酰水解酶基因Ss-oah1及其正调控转录因子基因Ss-PacI上调；此外，草酸脱羧酶基因Ssodc2下调（图8）。草酸 (OA) 是一种多功能分子，可以创造低pH环境以促进PCWDE活性、螯合钙以削弱宿主细胞壁结构及减少宿主钙毒性、抑制宿主防御反应等。该结果表明OA对于DT-8的定植也很重要，并且可能抑制油菜籽激活防御反应以有利于DT-8的存活。低pH环境也可能有助于建立DT-8菌株和油菜籽之间的共生关系。


图8

结论
在这项研究中，作者通过Dual UMI RNA-seq比较了核盘菌和油菜中的DEGs，解析了菌株DT-8在油菜中定植时DT-8和油菜之间的共生机制（图9）。对于油菜来说，油菜果胶酯酶和果胶裂解酶基因的上调表达可能促进菌株DT-8的定植；同时，油菜籽激活的防御反应不仅可以提高其抗病能力，还可以调节菌株DT-8的生长。在植物细胞壁降解酶、草酸和分泌蛋白的帮助下，菌株DT-8可以在油菜籽组织中定植；在淀粉酶/葡糖淀粉酶、糖转运蛋白的作用下，菌株DT-8可使用淀粉作为关键营养素。此外，菌株DT-8解毒基因的上调也有利于其定植。


图9

总之，通过转录组测序，作者发现营养获取方式的变化以及宿主与内生菌之间的拮抗平衡是关键因素。这项研究扩展了我们对病毒真菌-植物相互作用共生机制的理解，并为进一步开发低毒力真菌的实际应用奠定基础。当然，这项研究也存在局限性：首先，作者仅仅是在室内模拟环境中进行实验，与真正的自然环境截然不同；其次，作者研究的样本量也有限。因此，要真正阐明病毒介导的内生真菌及其宿主共生机制还需更进一步的深入。

文献来源：
Qu Z, Zhang H, Wang Q, Zhao H, Liu X, Fu Y, Lin Y, Xie J, Cheng J, Li B, Jiang D. 2021. Exploring the symbiotic mechanism of a virus mediated endophytic fungus in its host by dual unique molecular identifier–RNA sequencing. mSystems 6:e00814-21.