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多手段联合揭示circRNA翻译产物蛋白的促癌机制
人阅读 发布时间：2021-12-06 10:49
研究背景
环状RNA（circRNA）是一类由真核细胞产生，通过反向剪接（back splice），使线性RNA的5’和3’连接，形成共价闭合的环状结构，且在物种间高度保守。起初，circRNA被认为是mRNA加工或错误剪接的副产物，但近期研究发现， circRNA 可被翻译为未知蛋白亚型。 同时，m6A是RNA修饰最丰富的类型，能够促进circRNA翻译为蛋白质。但是，在人类癌症研究中，编码蛋白的circRNA实验数据较少。
在本研究中，作者发现了一种新型环状RNA-circARCARHGAP35，源于肿瘤抑制基因ARHGAP35，并经常在癌组织中上调。这个circRNA是否在癌症发生发展中有作用？如果有，作用机制又是什么呢？接下来，就跟随小编一起来看看作者的研究思路吧。
研究结果
一、circRNA鉴定
为了鉴定肝癌中重要的蛋白编码的circRNA，作者做了以下工作：
1. 作者挑选12对肝细胞癌组织和癌旁组织，对其进行circRNA-seq。差异分析显示，177个circRNA在HCC中下调表达，16个 circRNA在HCC中上调表达（下图A）。
2. qPCR分析显示，由ARHGAP35基因2、3号外显子反向剪接形成的circARHGAP35在HCC中上调表达，其对应的ARHGAP35基因下调表达（下图B）。
3. 荧光原位杂交（FISH）验证了circARHGAP35主要定位在细胞质中（下图F）。
4. 作者通过Northern blot（下图G）、RNase R消解（下图H）、放线|菌素D处理（下图I）等实验均证实，circARHGAP35是环状RNA。
二、circARHGAP35具有促癌作用
circARHGAP35在癌组织中上调，那么它是否能促癌呢？为了回答这个问题，作者做了一系列体外和体内实验。
1. qRT-PCR显示，在HuH-7、HCT-116细胞中，敲低circARHGAP35显著抑制了细胞增殖（下图B）和细胞的迁移和侵袭能力（下图C、D）；敲低ARHGAP35对细胞增殖并没有影响（下图B），但是促进了细胞的迁移和侵袭（下图C、D）。同时敲低circARHGAP35和ARHGAP35，细胞增值、迁移和侵袭无显著变化（下图C、D）。
2. 在裸鼠异种移植模型中敲低circARHGAP35，发现敲低circARHGAP35的小鼠肿瘤更小（下图I、J），肺转移比例更低（下图K、L）。而线性ARHGAP35的过表达显著抑制了HCT-116细胞的致瘤性肺转移能力。
综上所述，circARHGAP35和线性ARHGAP35在肿瘤中发挥相反的作用：circARHGAP35促进肿瘤细胞生长、侵袭和转移，而线性ARHGAP35作为肿瘤抑制因子，抑制细胞迁移和侵袭。
三、circARHGAP35具有蛋白编码能力
既然circARHGAP35起到促癌作用，那么它的机制是什么呢？作者首先从其蛋白编码能力着手：
1. 通过TRAP技术和质谱分析发现，circARHGAP35与蛋白翻译相关的EIF3I和EIF2S1相互作用（下图A、B）。
2. RIP-qPCR验证了circARHGAP35和EIF3I之间的相互作用（下图C）。
3. 序列分析显示，circARHGAP35存在一个3867nt的开放阅读框（ORF），含有宿主基因的起始密码子和终止密码子（下图D）。
4. 作者构建Flag标签融合载体和阴性对照，通过Western blot检测发现成环的circARHGAP35可以被翻译出蛋白（下图E）。使用识别ARHGAP35和circARHGAP35蛋白共有的N端序列抗体做Western blot，观察到p-circARHGAP35和p-circARHGAP35-Flag质粒都在ARHGAP35蛋白带下方有特定的蛋白带（下图E）。
5. 为进一步验证内源性circARHGAP35蛋白的存在，作者使用N端识别抗体进行Co-IP，观察到了源自circARHGAP35蛋白的特定肽片段（下图F）。
以上结果说明circARHGAP35具有蛋白编码能力。
四、circARHGAP35的翻译受m6A修饰调控
前期有研究报道，m6A修饰可以促进细胞中circRNA的翻译，circARHGAP35的翻译是否受到m6A修饰的调控呢？meRIP-qPCR显示，circARHGAP35存在m6A修饰（下图I）；过表达去甲基化酶FTO后，circARHGAP35的m6A修饰水平和蛋白表达显著下降（下图J、K），说明m6A修饰对circARHGAP35的翻译非常重要。
五、circARHGAP35的翻译产物具有致癌作用
circARHGAP35是以RNA形式，还是以蛋白的形式发挥作用呢？为了评估circARHGAP35蛋白的生物学功能，作者构建了与circARHAPGAP35相同ORF的线性模型（下图A、B）。作者发现circARHGAP35蛋白能够驱动癌细胞的集落形成和增殖，而ARHGAP35蛋白的影响很小或没有影响（下图C、D），此外，circARHGAP35蛋白增加了癌细胞系的迁移和侵袭能力，而ARHGAP35蛋白的作用则相反（下图E）。这些结果证明，circARHGAP35的蛋白产物能够促癌。
六、circARHGAP35蛋白与细胞核中的TFII-I相互作用
那么，circARHGAP35蛋白是通过什么机制促进癌症发展的呢？接下来，作者对circARHGAP35促进肿瘤进展的下游机制进行了研究。
1. ARHGAP35包含4个FF结构域和一个C端RhoGAP结构域，而circARHGAP35蛋白缺乏RhoGAP结构域（下图A）。
2. 免疫荧光检测显示circARHGAP35定位于细胞核，ARHGAP35定位于细胞质（下图B）。
3. ARHGAP35蛋白的异位表达显著抑制了RhoA的活性，而circARHGAP35蛋白对RhoA的活性没有显著影响（下图C）。
4. 有研究报道转录调控因子TFII-I和FF结构域之间存在相互作用。作者通过Co-IP，证实了TFII-I与circARHGAP35蛋白结合（下图F、G）。
5. 细胞增殖和迁移侵袭实验表明，过表达circARHGAP35蛋白可促进癌细胞的增殖和迁移侵袭，但是，干扰TFII-I后，效果显著下降（下图H-J），说明circARHGAP35蛋白主要通过TFII-I发挥促进癌细胞增殖和迁移侵袭的作用。
七、HNRNPL调控环状circARHGAP35的形成
下游机制清楚了，那上游又是什么分子在调控circARHGAP35呢？
1. 作者通过RNAi对63种与RNA剪切有关的蛋白进行沉默。其中，HNRNPL的沉默导致了circARHGAP35的下调，对线性ARHGAP35没有影响，符合前期的研究结果（下图A、B）。
2. eCLIP-seq数据显示，HNRNPL结合位点位于circARHGAP35位点的两侧。RIP-qPCR结果表明，HNRNPL中circARHGAP35显著富集，特别是位于intron1和intron3内的UP1和Down2（下图C、D）。
3. 基于这两个位点，作者构建了报告基因（下图E）。发现敲低HNRNPL后，成环效率显著降低（下图F），进一步证明了这两个位点对circARHGAP35的调控作用。
4. 此外，在HCC中，HNRNPL上调（下图G），且与circARHGAP35呈正相关（下图H、I），与线性ARHGAP35不相关。
综上所述，HNRNPL促进了circARHGAP35的RNA表达，HNRNPL高表达水平导致了HCC中circARHGAP35的上调。
八、circARHGAP35的上调与癌症患者生存率差相关
为研究circARHGAP35在癌症中的潜在临床意义，作者在110对HCC和癌旁组织中检测了circARHGAP35和线性ARHGAP35的表达。
1. 在HCC中，circARHGAP35表达显著上调（下图A），线性ARHGAP35表达下调（下图C）。
2. Kaplan-Meier生存分析显示，高表达circARHAPGAP35与较短的总生存期（OS）、较短的无病生存期（DFS）和较高的复发率相关(下图E)，而高线性ARHGAP35表达的患者有更好的预后（下图F）。
3. 结合circARHGAP35和线性ARHGAP35的表达时，高circARHGAP35水平和低线性ARHGAP35水平的患者OS和DFS更短，复发率更高（下图G）。
研究总结
1. 作者鉴定到了一种来自肿瘤抑制基因ARHGAP35的新型环状RNA circARHGAP35，体内外的功能实验显示circARHGAP35具有促癌作用，而ARHGAP35则有抑癌作用；
2. circARHGAP35在起始密码子附近含有多个m6A的修饰，促进其被翻译成蛋白；
3. circARHGAP35蛋白通过结合TFII-I发挥其促癌作用，而ARHGAP35通过降低RhoA活性抑癌；
4. 通过对RNA结合蛋白的筛选，发现HNRNPL能促进circARHGAP35的生成，且在circARHGAP35成环序列两侧存在结合位点。HNRNPL高表达导致了HCC中circARHGAP35上调。
5. circARHGAP35的上调与与较短的总生存期、较短的无病生存期和较高的复发率相关。
文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202001701
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